ACE2基因敲除小鼠

1． ACE2(血管紧张素转换酶2，angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 2)基因 

血管紧张素转换酶(ACE)由805个氨基酸组成，其中包括一个N末端信号序列，一个单活性位点催化区和一个C末端疏水的膜锚定区,对肾素—血管紧张素系统(RAS) 有关键调控作用。ACE2在啮齿类动物和人类中主要分布在心脏、肾脏和睾丸。ACE2 能水解血管紧张素(Ang),产生Ang2(129),还能水解RAS 中的主要物质AngⅡ,产生具有血管扩张作用的Ang2(127) 。另外，ACE2 可能在RAS 中扮演与ACE 相反的角色,以达到血管收缩和舒张的平衡,并与高血压的发生关系密切。糖尿病肾病小鼠肾小管的ACE2 水平明显下降,提高ACE2 水平则可能预防糖尿病肾病的疾病进程。

   人类ACE2基因位于Xp22，由18个外显子和20个内含子组成。迄今已知该基因的单核苷酸多态性（single oligonucleotide polymorphism，SNP）位点有140个。ACE和ACE2的金属蛋白酶催化区有42%是一致的，而对二者基因结构的对比分析更发现ACE2基因所包含的18个外显子与ACE基因的头17个外显子的结构具有相当大的类似性。

2. ACE2的表达及基本功能

(1) ACE2是一种膜联羧肽酶，高度表达于心脏、肾脏、睾丸以及胃肠道，被认为是RAS系统的负向调节因子。最近对于ACE2的研究认为，ACE2主要作用是通过水解AngII产生扩血管作用的Ang-（1-7）而与ACE的作用抗衡 。另外，研究发现ACE2基因敲除鼠出现心室扩大和严重的心肌收缩功能不良 ，说明ACE2在调节心血管功能方面也具有重要性。

(2)ACE2目前已知功能主要包括改善心肌收缩力、 缓解心肌梗塞和心力衰竭；调节血压、血流；改善肾功能，与糖尿病性肾病相关以及作为SARS冠状病毒的功能性受体等。它的发现为心血管疾病，糖尿病综合征以及SARS的研究和治疗提供了新型有效的治疗手段。ACE2作为刚刚发现的一种物质，其强大的生物学效应越来越多的得到证实，并且其作用还不仅局限于心血管系统，作为SARS 的功能性受体，ACE2将很有可能成为其治疗的新途径，为这一疾病的治疗带来了希望。由于ACE2不仅能阻止AngII的形成，同时还可以通过产生Ang-（1-7）作为血压调节的手段，因此成为高血压疾病的新型、强大的基因治疗靶点，必将在今后心血管疾病的研究及治疗中发挥重要的作用。

3． ACE2 基因敲除( ACE2 -/-) 小鼠的表型  

ACE2 基因敲除( ACE2-/-) 小鼠的功能受到损害，具有心室扩大和严重的心肌收缩功能不良症状。

     ACE2 基因敲除的Ang Ⅱ水解明显减少，Ang Ⅱ水平增高，但不足以引起血压升高。研究发现，6 月龄ACE2 基因敲除雄性小鼠收缩压与平均动脉压均下降,心肌收缩力减弱。6 月龄的雌性小鼠心肌收缩力减弱，但血压并未下降。二者AngⅡ水平均增高。可能有其他的多肽物质调节ACE2-/-小鼠的血压，从而拮抗Ang Ⅱ水平增高引起的高血压。ACE2 缺失导致Ang Ⅰ水平增高，后者则在中性肽链内切酶(NEP) 作用下转化成Ang2(127)。而Ang2(127) 可能会拮抗Ang Ⅱ的血压增高作用，并加强缓激肽的扩血管作用。

     ACE2 基因敲除小鼠的心肌收缩力减弱，射血分数( EF) 下降40% ，心室轻度增大，左心室壁轻度变薄，但未发现心肌间质纤维化和心肌细胞肥大。在ACE2 基因敲除小鼠中还发现大量冬眠心肌和抑顿心肌，提示ACE2 可能防止心肌缺血。另一研究也发现，ACE2 基因敲除小鼠的低血氧基因BNIP23(诱导细胞死亡的线粒体蛋白) 和纤溶酶原激活物抑制剂21 (PAI21) 上调，这表明ACE2 基因敲除小鼠有慢性心肌缺氧。

参考文献：

Crackower MA , Sarao R , Oudit GY, et al . Angiotensin converting enzyme 2 is an essential regulator of heart function. Nature ,2002 ,417 :822- 828.

Qudit GY, Crackower MA ,Backx PH ,et al . The role of ACE2 in cardiovascular physiology. Trends Cardiovasc Med , 2003 ,13 :932101

     ACE2（血管紧张素转换酶2，angiotensin - converting enzyme2）是一种与ACE相似的酶，在肺、心脏、肾脏和胃肠等组织器官的血管内皮细胞中表达，是肾素-血管紧张素系统(rennin- agiotensin system, RAS) 的重要组成部分，通过调节血管紧张素I 和血管紧张素II 的转换来调节血压，在生理状态及高血压、慢性心力衰竭、糖尿病等病理生理过程中与 ACE互相拮抗，其作用主要是通过ACE2的催化产物Ang（1-7）实现的。ACE2不仅代谢AngI、AngII，还代谢其他肽类系统，是心血管功能的重要调节器。同时，ACE2又是SARS-CoV的功能性受体。ACE2基因小鼠没有明显的血压改变，但左心室壁轻度变薄，心肌收缩力严重下降，没有心肌间质纤维化和心肌细胞肥大，提示ACE2可能介导心肌缺血。可用于心脏血压调控的研究，也可作为SARS动物模型。

ApoE基因敲除小鼠原理描述

 ApoE基因敲除小鼠品系描述：

     ApoE基因敲除小鼠原理是除LDL以外的所有脂蛋白的结构组成，在维持血脂代谢的平衡中起关键作用。ApoE功能缺失会导致胆固醇清除途径受限，胆固醇残粒在血浆中沉积。ApoE基因敲除严重高胆固醇血症小鼠是首个自发性动脉硬化基因工程小鼠模型，是目前在AS研究领域中应用最多的基因工程动物。ApoE基因敲除小鼠的血浆胆固醇浓度升高5倍，甘油三酯升高68％。血浆LDL和VLDL水平显著高于正常对照组，HDL水平则低于正常小鼠。3月龄ApoE基因敲除小鼠可在临近大动脉附近发现脂肪纹，它们会对机体造成损害，并且这种损害随年龄增长及脂质减少而增加，8月龄时可见严重的冠状动脉堵塞, 17月龄以上ApoE基因敲除小鼠脑部可见晶状胆固醇裂隙和脂质滴，泡沫细胞中有黄瘤的损害，小的黄瘤在脉络丛和腹侧穹中也能看到。病变形态、位置及发展过程均与人类相似，另外在行为上，ApoE基因敲除小鼠对应激反应减弱、学习与记忆功能改变，可用于研究apoE缺失在乙酰胆碱神经损害所致认知障碍过程中发挥的作用。

ApoE基因敲除小鼠应用领域：

（1） 糖尿病和肥胖研究：非糖尿病型肥胖(饮食诱导的)；

（2） 神经生物学研究：阿耳茨海默氏病，行为和听力缺陷，神经变性；

（3） 心血管研究：动脉粥样硬化，血胆固醇过高；

（4） 鼠/人的同源基因：阿耳茨海默氏病，高脂蛋白血症。

ApoE转基因小鼠原理描述

    ApoE基因有三个等位基因，即E2、E3和E4，共构成六种不同的基因型：3种纯合型(E2／E2、E3／E3、E4／E4)和三种杂合型(E2／E3、E2／E4、E3／FA)。各种基因分型与心血管疾病、脑中风以及阿尔茨海默症的发生有一定程度的关系，其中又以E3／E4、E4／E4这两种基因分型最具罹患这类疾病的风险。利用CMV启动子系统表达ApoE2、ApoE3和ApoE4基因的转基因小鼠是研究ApoE基因与冠心病、高脂血症、脑栓塞等疾病相关性和发病机制的重要模型。

 APP/PS1双转基因痴呆症小鼠APP小鼠

 APP/PS1双转基因痴呆症小鼠品系描述：

APP/PS1双转基因的小鼠可表达突变的人类早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉样前蛋白（APPswe）融合体，这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。人类早老素基因的DeltaE9突变是该基因的第九个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。对app/ps1双转基因小鼠脑蛋白匀浆进行免疫检测发现，人类早老素蛋白高水平地替代了可检测到的小鼠内源性蛋白，并且，在脑匀浆中还检测到了人源淀粉样前蛋白。据研究者报道，6-7月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑内会形成beta淀粉状蛋白沉淀。

APP/PS1双转基因痴呆症小鼠应用领域

    1) 老年痴呆症的人/鼠基因同系物研究

    2) 老年痴呆症和神经退行性变化的神经生物学研究

    基因敲出小鼠是利用基因打靶技术产生转基因动物的程序，基因敲出小鼠程序一般为：(1)构建基因打靶载体; (2)将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达; (3)筛选发生同源重组的阳性克隆，基因敲出小鼠构建通过显微注射或者胚胎凝集的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内制作嵌合体小鼠，在生物活体中研究特定基因的功能。基因敲除小鼠使得研究者们能够观察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改变，从而推断出特定基因的作用。基因敲出小鼠基因打靶的原则是, 外源DNA 片段含有与目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列, 同源重组就发生在这两个序列之间。外源DNA 序列的定位整合有两种方式, 即插入型(又称O 型) 和置换型(又称8 型)。与此相对应, 基因敲出小鼠打靶载体可分为两类: 插入型载体和置换型载体。

基因敲除小鼠第一步，胚泡时期发育胚胎的分离。此胚胎来源于灰色品系的小鼠。
基因敲除小鼠第二步，从灰色小鼠胚泡中分离胚胎干细胞，在体外进行培养。

基因敲除小鼠第三步，用同源重组载体转染胚胎干细胞，用含有新霉素和更昔韦洛的培养基筛选发生了同源重组的细胞。
基因敲除小鼠第四步，将筛选得到的胚胎干细胞植入白色小鼠的早期胚胎（胚泡时期）中。

基因敲除小鼠第五步，将上述胚胎植入假孕母鼠（白色）子宫中。

基因敲除小鼠第六步，在母鼠所产的小鼠中，有一些是正常的白色，另一些则是嵌合体灰白相间的小鼠。这些嵌合体小鼠的细胞一部分起源于白色皮毛的胚泡细胞，另一部分则起源于重组的胚胎干细胞。起源于重组胚胎干细胞的皮毛显示出灰色斑块，很好辨认。
基因敲出小鼠第七步，嵌合体小鼠与野生型白色小鼠进行杂交，如果嵌合体小鼠的生殖细胞恰好是起源于重组胚胎干细胞，那么其子代小鼠就都应该呈现灰色。而这些灰色小鼠的所有细胞都是杂合体。
基因敲除小鼠第八步，杂合体灰色小鼠（+/H）之间进行杂交，得到灰色和白色的子代。从灰色子代中筛选出纯合小鼠（H/H），其一对同源染色体上的等位基因都失活，此纯合小鼠即为 “基因敲除小鼠”。
我们有开发的基因敲除小鼠APOE(动脉硬化研究),

PEPT(白内障研究)

Shh+/- 基因敲除小鼠等小鼠: Shh（Sonic hedgehog）基因在脊椎动物胚胎组织形成中起着重要的作用，包括大脑、脊椎、中轴骨骼和四肢的形成。基因敲除小鼠基因缺失的胚胎早期可以观察到中间结构如脊索和地板的形成和维持的影响，晚期可以观察到远肢结构的缺失以及独眼，腹部细胞包括神经管的缺失、脊柱和许多肋骨的缺失。Shh蛋白被证实是脊椎动物发育过程中组织形成所必须的胞外信号。