前言

在盐生环境中，Na⁺的毒性是降低植物生长能力的一个主要原因。在农业生产中经常使用几种方法来减少Na⁺的毒性，使用复合物，例如石灰、石膏。在不同的植物中广泛报道了增加Ca²⁺可以改善Na⁺的毒性。然而，在细胞水平Ca²⁺的调节机制并未完全得知。Ca²⁺和大量的胞内和胞外标记物发生相互作用而减少Na⁺的毒性。目前，SOS胁迫信号途径是盐胁迫下植物离子动态平衡的关键调节者。盐胁迫激活了SOS3-SOS2蛋白激酶途径从而引起了胞质Ca²⁺浓度的升高。这导致质膜Na⁺外流转运体SOS1和通过质膜高亲和转运体HKT1的Na⁺内流，因此帮助细胞保持K⁺/Na⁺的动态平衡。胞液中Ca²⁺浓度上升的范围依赖于胞外的Ca²⁺浓度，直接支持这个模型的实验证据一直很缺乏。

增加胞外Ca²⁺浓度能够通过CaM依赖的蛋白激酶刺激质膜H⁺-ATPase的活性。在盐胁迫条件下，增加质膜H⁺-ATPase活性对于膜电压的重新极化是必需的，从而保持膜的完整性和离子的动态平衡。通过SOS1 Na⁺-H⁺反向转运体控制的Na⁺外流最终依赖于H⁺-ATPase的活性。拟南芥根内胚层质膜H⁺-ATPase活性的丧失导致对盐的敏感性。SOS3-SOS2途径的Ca²⁺刺激过Na⁺-H⁺反向转运体促进液泡Na⁺的丢失。因此，Ca²⁺作为一个胞内调控者在盐忍耐中起到重要作用。

Ca²⁺提供快速的保护作用，而细胞壁、膜脂和蛋白质提供长期的保护作用来抵御盐胁迫。胞外Ca²⁺通过Na⁺内流抑制质膜渗透性非选择阳离子通道（NSCCs）。使用多种电生理技术进行研究，例如：非损伤离子流测定技术、多种平行离子选择电极技术、膜片钳技术、膜电位测定。在根和叶片细胞中，胞外的Ca²⁺能够通过质膜外表K⁺渗透通道直接抑制减少或者完全阻止Na⁺诱导的K⁺流失， 这是Ca²⁺通过K⁺通道改善Na⁺诱导的毒性的另一种关键过程。

本文重点介绍：如何准备适用于非损伤微测技术测定的植物组织样品，如何进行测定，以及得到的结果。

材料和方法

1 植物材料

拟南芥：野生型（Columbia），akt1突变体

2 利用非损伤微测技术测定净K⁺和Na⁺的流动

使用离子选择振动微电极进行非损伤测量K⁺和Na⁺的净流量。电极在使用前用一套标准溶液进行校正，0.1-1mM的K⁺，0.2-50mM的Na⁺。离子选择电极放置于可控制三维运动的操纵器上，电极尖端距离组织表面20μm。测量时，计算机控制电极在距离组织表面20μm和50μm的两点间移动，频率为0.2Hz。记录的电势差使用校正电极的Nernst斜率转换成电化学电势差，离子的流动通过MAGEFLUX进行计算。

叶片表皮组织用镊子从叶表皮分离得到，切取小块组织（3-×4mm），尽可能地避免对组织的伤害，准备好几小时后开始离子流的测定，使用NMT(或称MINF)测定拟南芥的根尖（切取大约8mm的根尖部分）。根或者叶片水平固定在4mL 的测量容器中，测试液是碱性溶液，包括0.2mM KCl，2mM MES，4mM Tris （pH 5.8），以及少量的CaCl₂，放在三维操作系统上。稳定状态的离子流测定5-10分钟。然后测定的结果转换成离子流动力学。

研究结果

1 拟南芥根和叶片中NaCl诱导Ca²⁺敏感的K⁺外流

根成熟表皮（A）和叶肉组织（B）在不同的Ca²⁺浓度中K⁺流速的不同响应

2 NaCl诱导K⁺外流与Cl^-或渗透刺激无关，对TEA⁺敏感

NaCl诱导的K⁺外流反应和Cl^-无关，由于50mM 葡萄糖酸钠在拟南芥根中引起和50mM NaCl基本同样的反应。当添加等压的85mM 的甘露醇来代替50mM 的NaCl时，没有K⁺外流。同样的结果也在叶肉组织中观察到。NaCl诱导的K⁺外流很大程度上被K⁺通道抑制剂TEA⁺抑制，但是不被Ca²⁺通道抑制剂戊脉安（verapamil）抑制。对TEA⁺的敏感是K⁺通道内在的特性，与其他的阳离子渗透通道不同，例如NSCCs和Ca²⁺通道，这些对TEA⁺不敏感。

3 NaCl诱导的K⁺外流先于Na⁺的内流

向内调节不涉及到NaCl诱导的K⁺流失

提高Na⁺浓度诱导Ca²⁺敏感的净K⁺的外流可能通过质膜TEA⁺敏感的外表直接的K⁺通道的活化作用所调节。

研究结论

NaCl引起的K⁺流失是由于Na⁺诱导的TEA⁺敏感K⁺的外流，非常可能是由两个渗透通道的成员DAPCs和NSCCs调节。提高调节了拟南芥根和叶片中的这些通道并且阻止了K⁺的流失。在盐胁迫下，Na⁺显著抑制DAOCs，但是不抑制NSCCs。因此，K⁺外流的敏感成分很大程度上视NSCCs的情况而定。这些结果挑战Ca²⁺在植物中发挥作用机制的传统观点。Ca²⁺对Na⁺内流的抑制效应是通过NSCCs实现的，非质体Ca²⁺通过直接和间接调节K⁺外流通道来阻止K⁺的流失。

采用非损伤微测技术来测定K⁺和Na⁺的净流量以及胞液中K⁺流速，探明了K⁺通道中的K⁺变化情况。对于认识盐胁迫下不同离子所引起的抗性作用有重要的意义。非损伤微测技术能够精确地测定离子流的瞬时变化以及长期变化的过程。由于它所具有的这种优势，已经在小分子物质的测定方面得到广泛的应用。在此文中，这个技术的应用对于揭开Ca²⁺所引起的K⁺渗透通道来改善K⁺流失并去除Na⁺的毒害有明显优势。

参考文章：

Shabala S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ, Davies JM, and Newman IA. (2006) Extracellular Ca²⁺ ameliorates NaCl-induced K⁺ loss from Arabidopsis root and leaf cells by controlling plasma membrane K⁺-permeable channels. Plant Physiology, 141: 1653-1665

点击以上链接，下载PDF全文。