5-羟色胺ELISA试剂盒使用说明

2011-09-07 来源:本站点击次数:4321

5-羟色胺ELISA试剂盒使用说明

(德国IBL:RE59121)

1、 应用范围

此试剂盒可用于人血清、血浆、血小板和尿液中五羟色胺的体外定量检测。进一步的研究表明：此试剂盒还可用于组织匀浆和细胞培养上清液的研究。

2、前言说明

五羟色胺是色氨酸代谢的中间产物，它主要存在于肠嗜铬细胞、血清素激活的神经元和血小板中，它已被确定为是中枢神经系统的一种神经递质。循环血液中的五羟色胺几乎都集中于血小板内。循环五羟色胺浓度的变化可反映出人体的一些病理变化，这些病理变化包括：慢性肌紧张性头痛、精神分裂症、高血压、舞蹈症、杜氏肌肉萎缩症和早期急性阑尾炎。血清五羟色胺的检测对类癌综合征的检测具有重要临床意义。人们预计：在不久的将来，人们对血小板内五羟色胺的研究兴趣（包括五羟胺的吸收及释放动力学研究）应该会不断增长。

3、实验原理

样品准备（将五羟色胺转变为N-乙酰五羟色胺）是样品的稀释的一部分，将每一份样品分别于酰化试剂一起温育就可以得到酰化的五羟色胺。此实验采用的是竞争性ELISA的原理，生物素标记的和非生物素标记的抗原竞争性结合到一定数量的抗体结合位点上。最后，结合到抗体上的生物素标记抗原的量于样品中被分析物的浓度成反比。当反应系统达到平衡后，洗板除去未结合的生物素标记抗原，用抗生物素碱性磷酸酶做标记、对硝基苯磷酸做底物来检测结合到抗体上的生物素标记抗原的量。用已知标准品做一条标准曲线，将未知样品的酶活性在标准曲线上进行定标就可以得到未知样品中五羟色胺的浓度。

4、贮存与稳定性

试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8℃，避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。打开了的试剂盒在有效期内稳定，前提是要将试剂盒用袋子密封并储存于2-8℃的环境下。

5、样品的采集与储存

注意	有些食物会含有一定量的五羟色胺，另外，有些药物也会刺激五羟色胺的释放，从而导致五羟色胺的浓度升高。病人应当禁食富含五羟色胺的食物，如：阿司匹林、促肾上腺皮质激素、MAO抑制剂、phenazetin、儿茶酚氨、利血平和烟碱。

血清

注意静脉穿刺采集全血的常规注意事项。从采集到血液样品的那一刻起到检测时都应保持血液样品的化学整体性。不要使用明显溶血、黄疸血和脂血样品。如果样品出现混浊，则在实验前应当离心以除去所有的微粒物质。
贮存	18-25℃	2-8℃	≤-20℃	避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。
稳定性	2小时	6小时	3个月	避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h内的所有尿液，之后将其加入到10-15ml 6N的HCl防腐剂中。确定用于结果结算的总体积。使用前请将所有样品混合并离心。
贮存	≤-20℃	避免热源或太阳直射，避免反复冻融。
稳定性	6个月

血浆、血小板

98%以上的循环五羟色胺都位于血小板内，在血液凝集时就可以释放出来。用静脉穿刺的方法将全血收集到含EDTA或柠檬酸的塑料试管中（如10mlMonovette NC试管中加入1ml柠檬酸溶液）。室温下，将全血样品以200×g的速率离心10分钟得到富含血小板的血浆（PRP）。将PRP-上清转移到另一试管中。为了获得血小板乳糜微粒，我们将200ulPRP（350000～500000个血小板/ul）加入到800ul生理盐水中，之后4℃下以4500×g的速率离心10分钟（或4℃下10000×g的速率离心2分钟）。离心后弃取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul双蒸水，之后样品就可以在-20℃以下的环境下冻存数周了。将冻融的样品在室温下以1000×g的速率离心2分钟。整个实验需要使用20ul上清液（见酰化）。如果您想测无血小板血浆（PFP）中五羟色胺的浓度，我们可以将PRP在4℃以4500×g的速率离心10分钟（或4℃下10000×g的速率离心2分钟）就可以获得无血小板血浆（PFP）。游离五羟色胺的ELISA实验要使用50ul上清液（见酰化）。注意：PRP中五羟色胺的直接检测实验表明：大约10%的PRP样品可以检测到不可预知的高浓度五羟色胺（结果用高效液相层析和流氏细胞术获得）。为了避免这种差异性，我们建议您即检测血小板中五羟色胺，也检测无血小板血浆中的五羟色胺。
	无血小板血浆	血小板微粒(从血浆中分离得到)		避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。
储存	≤-20℃	≤-20℃	≤-80℃
稳定性	2周	4周	1年

组织匀浆和细胞培养上清

使用组织匀浆和细胞培养上清作样品，一般无特殊注意事项注意：细胞培养基可能含有一定量的五羟色胺！
储存	≤-20℃	避免热源或太阳直射，避免反复冻融。
稳定性	6个月

6、试剂盒成分

注意	试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测所需的试剂成分。

数量	标记	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。
1×5ml	ANTISERUM	组胺抗血清，蓝色，即用，内含：兔抗血清、Tris缓冲液和0.01%的NaN₃。
1×5ml	BIOTIN	五羟色胺生物素，黄色，即用，内含0.1%的NaN₃。
1×0.2ml	ENZCONJ CONC	酶联物，10倍浓缩，内含碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体、Tris缓冲液、HCl和0.01%的NaN₃。
1×7×0.5ml	CAL A-G	标准品A-G，0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml,0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l,即用，内含酰化的五羟色胺、磷酸盐缓冲液和0.1%的NaN₃。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	质控品1+2，冻干，内含人血清和0.02%的NaN₃。具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签。
1×3ml	ACYLREAG	酰化试剂内含乙酸酐和丙酮，即用
1×50ml	ASSAYBUF CONC	检测缓冲液，10倍浓缩，内含磷酸缓冲液、BSA和1%的NaN³。
1×50ml	WASHBUF CONC	洗涤液，20倍浓缩，内含磷酸缓冲液、吐温和0.1%的硫柳汞。
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，密封于铝铂金属袋内，内含对硝基苯酚磷酸盐。
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物缓冲液，即用，内含二乙醇胺、水和0.05%的NaN₃。
1×15ml	PNPP STOP	PNPP终止液，即用，内含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
3×	FOIL	粘性金属板

7、实验所需器材但试剂盒不提供

1）移液器，体积：20;25;50;100;1000ul

2）玻璃试管（12×75mm）

3）试管架

4）振荡器（500rpm）

5）旋涡混合器

6）水浴箱，37℃

7）带储器的8道移液器

8）洗涤瓶，自动或半自动洗板机

9）离心机：≥1500×g

10）可在405nm处读数的酶标仪（参考波长：600-650nm）

11）双蒸水或去离子水

12）吸水纸、取样吸头和计时器

8、实验前的准备说明

供手动和自动操作参考用

注意	用于96孔检测的试剂成分可分成3次用。下述体积是使用4条（32孔）时所需要的体积。如果客户想将标准品从7支减为6支的话，我们可以省掉标准品G。则检测范围相应的减少到155ug/l（血浆）或706ug/l（血清，尿液，组织匀浆和细胞培养上清）。血清、尿液、组织匀浆和细胞培养上清样品可以选择简短操作步骤进行，只需温育3.5个小时（但血浆样品不能采用简短操作步骤进行），以上样品也可以选择可选操作步骤进行检测（将样品温育一整夜），血浆样品必须按照温育一整夜进行检测。

8.1冻干或浓缩成分的准备

稀释/溶解	成分	加入	稀释剂	比例	备注	储存	稳定性
15ml	检测缓冲液	150ml	双蒸水	1:10	出现黄褐色并不会影响实验结果	2-8℃	2周
15ml	洗涤液	300ml	双蒸水	1:20		2-8℃	4周
	质控品	0.5ml	双蒸水		静置15min,混合时无泡沫	≤-20℃	有效期内稳定
60ul	酶联物	6ml	稀释的检测缓冲液	1:101	临时配置,只能使用一次	18-25℃	2小时
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物缓冲液		临时配置，只能使用一次	18-25℃	5小时

8.2样品的稀释

样品五羟色胺浓度高于最高标准品的必须用检测缓冲液进行进一步的稀释。

8.3样品和质控品的酰化

样品A：血清，尿液，血小板提取物，组织匀浆和质控品

样品B：无血小板血浆

注意	请不要酰化标准品，标准品已经酰化了。样品准备可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、组织匀浆和细胞培养上清被稀释107倍，而血浆样品则被稀释23.5倍。结果计算时必须将此稀释因子考虑进去。

8.3.1样品A：血清、尿液、血小板提取物、组织匀浆和质控品

1	将质控品和样品A分别20ul加入到玻璃试管中。
2	在每一试管中加入100ul稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。
3	在每一试管中加入25ul酰化试剂1（3%），加入后立即旋涡混合。
4	将试管盖好，将试管放到37℃水浴箱内温育15分钟。
5	在每一试管中加入2ml已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合
6	1500×g下离心10分钟
注意	准备好的样品必须立即检测。其上清可在18-25℃下稳定存放1小时。

8.3.2样品B：无血小板血浆

1	将50ul样品B加入到玻璃试管中。
2	在每一试管中加入100ul稀释好的检测缓冲液，旋涡混合。
3	在每一试管中加入25ul酰化试剂，加入后立即旋涡混合。
4	将试管盖好，将试管放到37℃水浴箱内温育15分钟。
5	在每一试管中加入1ml已稀释好的检测缓冲液，旋涡混合
6	1500×g下离心10分钟
注意	准备好的样品必须立即检测。其上清可在18-25℃下稳定存放1小时。

9、实验步骤

9.1简短操作步骤（仅供样品A使用，不能应用于血浆）

1	将标准品、酰化好的质控品和酰化好的样品各50ul加入到相应的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羟色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羟色胺抗血清。
4	盖板，室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育90min。
5	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次,吸水纸上拍干以除去残余液体。
6	在每一微孔中加入150ul临时准备好的酶联物。
7	盖板，室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育60min。
8	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次,吸水纸上拍干以除去残余液体。
9	如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔间的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。
10	在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。
11	室温（18-25℃）下振荡（500rpm）温育60min。
12	在每一微孔中加入50ul PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振板以使溶液混合均匀。
13	加终止液后60min内405nm处读取OD值。

9.2可选操作步骤（温育一整夜，样品A和样品B均适用）

9.2.1第一天

1	将标准品、酰化好的质控品和样品分别50ul加入到相应的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羟色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羟色胺抗血清。
4	盖板，轻轻振板，2-8℃下温育16-20小时（一整夜）。

9.2.2第二天

1	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干以除去参与液体。
2	在每一微孔中加入150ul临时配置好的酶联物。
3	盖板，室温振荡器上（500rpm）温育60分钟。
4	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干以除去残余液体。
5	如果有条件的话，可以用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液时，每孔间的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。
6	在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。
7	室温振荡器上（500rpm）温育30分钟。
8	在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，振板以混合孔内成分。
9	加终止液后60min内405nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm）

10、结果计算

将所有标准品、质控品和样品的OD值减去空白孔的OD值。在半对数坐标纸上，以标准品的OD值（Y轴，线性）对其浓度（X轴，对数）绘制出一条标准曲线，或采用自动计算的方法绘制出一条标准曲线。用Cubic spline、4参数或双对数可以得到较好的曲线图。在计算标准曲线时，应当应用到每一个标准品数值（两个数值中，明显逸出的数值应当被忽略掉，采用更加合理的一个数值用）。样品的浓度可以从标准曲线上定量得到。

由于样品被稀释了，所以最终样品结果必须乘以相应的稀释因子，单位为ng/ml。

血清、尿液、血小板、组织匀浆、细胞培养上清、质控品： ×107

无血小板血浆： ×23.5

进行了进一步稀释的样品结果应当乘以相应的稀释因子。

实验必须满足如下标准才符合要求：

50%OD/Odmax（ED50）：0.60-1.00ng/ml（平均0.8ng/ml）

△OD标准品A-标准品G≥0.80OD

转换系数：

五羟色胺（ng/ml）×5.67=nmol/l

如果样品中五羟色胺浓度高于最高标准品，则此样品必须按照实验前准备说明进行稀释并重新检测。

11、期望值

实验结果不能当作任何治疗结果的唯一原因，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（97.5%）：

样品	数量	单位	平均值	范围
血清	99	ng/ml	88.6	30-200
无血小板血浆	35	ng/ml	3.7	1.8-7.5
血小板	35	ng/10⁹血小板	490	217-861
24小时尿液	49	μg/d	83.1	≤200

（建议每个实验室读确定自己的正常值范围）

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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