多巴胺ELISA试剂盒使用说明

2011-09-07 来源:本站点击次数:2367

多巴胺ELISA试剂盒使用说明

（德国IBL：RE59161）

1、 应用范围

此试剂盒可用于人血浆和尿液中多巴胺的体外定量检测，可手动操作，也可自动操作。进一步的研究表明：此试剂盒还可用于组织匀浆和细胞培养上清液的研究。

2、前言说明

儿茶酚氨类激素肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺主要由肾上腺髓质、交感神经系统和大脑产生。它们几乎影响所有的组织，并与其它激素和神经系统一起参与各种生理过程的调节。在许多疾病中，儿茶酚氨激素及其代谢产物间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素的分泌量都会增加，因而这些激素可用于疾病的诊断。所以，这些激素的检测对于疾病的诊断及神经系统肿瘤疾病的具有重要意义。它主要用于嗜铬细胞瘤的诊断，当然也用于成神经细胞瘤和神经节细胞瘤的诊断。因为在实验一开始时有提取步骤，所以用户可使用各种各样的动物材料进行实验。如果用此试剂盒测大鼠、小鼠或其它动物，则儿茶酚氨的化学结构与动物的相同。

3、实验原理

此固相酶联免疫吸附实验利用的是ELISA的夹心法。微孔中包被了羊抗兔抗体。在温育时间之内，加入的溶液抗在体可直接与抗原分子上的一个表位结合。样品中的抗原与酶标二抗（可与抗原分子上的不同表位结合）在包被孔中温育。加入底物液后，溶液所显示的颜色强度与样品中抗原的量成正比。样品的结果可直接用标准曲线确定。

4、贮存与稳定性

试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8℃，避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。开封的试剂盒在有效期内稳定，前提是要将试剂盒用袋子密封并储存于2-8℃的环境下。

5、样品的采集与储存

注意	人体内的儿茶酚氨和间甲肾上腺素的释放会受到一些食品和药物的影响。因此在样品采集前72小时内病人应禁止服用下列食物和药品：维生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制剂，还有降血压类药物。

血浆（EDTA）

注意	血液采集后两小时内，将血液样品冷藏于2-8℃的环境下直致离心获取血浆。
注意静脉穿刺采集全血的常规注意事项。从采集到血液样品的那一刻起到检测时都应保持血液样品的化学整体性。不要使用明显溶血、黄疸血和脂血样品。如果样品出现混浊，则在实验前应当离心以除去所有的微粒物质。
贮存	2-8℃	≤-20℃	避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。
稳定性	6h	1个月

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h内的所有尿液，之后将其加入到10-15ml 6N的HCl防腐剂中。
贮存	≤-20℃	避免热源或太阳直射，避免反复冻融，冷冻状态下运输样品。
稳定性	6个月

6、试剂盒成分

注意	试剂盒所提供的试剂足够做96孔单孔检测或48孔双份检测。

注意	此包被板也可用于检测肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺。

数量	标志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，单克隆）。
1×6×2.5ml	CAL A-F	标准品A-F 肾上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml(0;8;27;82;273;819nmol/L) 去甲肾上素:0;5.0;15;50;150;500ng/mL(0;30;89;296;887;2955nmol/L) 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL(0;78;228;750;2938;14688nmol/L) 即用,内含:肾上腺素-去甲肾上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl
1×2×2.5ml	CONTROL 1+2	质控品1+2 即用,含: 肾上腺素-去甲肾上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl,具体浓度及可允许范围请见试剂瓶标签.
1×250μL	ENZCONJ CONC	酶联物浓缩型（100×）内含：碱性磷酸酶标记的抗体，Tris缓冲液，HCl，0.01%的NaN3
4×	EXTRPLATE	提取板（微孔板）每板24孔，包被了硼酸亲和凝胶。
2×60ml	EXTRBUF	提取缓冲液粉红色，即用，内含：0.016%的NaN3
1×1.25ml	COMT LYO	COMT冻干粉内含：儿茶酚-氧位-甲基转移酶（猪肝），NaN3
1×2ml	COMT ADD	COMT添加剂内含：人血浆，稳定剂，0.01%硫柳汞。
1×7ml	ANTISERUM DO	多巴胺抗血清紫罗兰色，即用，内含：抗多巴胺抗体（兔），缓冲液，稳定剂。
2×1.25ml	COENZ	酶联复合物即用，内含：S-腺苷-L-蛋白酸，稳定剂。
1×3ml	ENZBUF	酶缓冲液即用，内含：Tris缓冲液，HCl，稳定剂。
4×13ml	RELEASEBUF	Release缓冲液黄色，即用，内含：0.1M的HCl，指示剂。
2×3ml	ACYLREAG	酰化试剂即用，内含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。
2×50ml	WASHBUR CONC	洗涤液浓缩型（10×）内含：Tris缓冲液，HCl，吐温，0.2%的NaN3
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片内含：对硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物缓冲液即用，内含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3
1×15ml	PNPP STOP	PNPP终止液即用，内含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
1×20ml	HCl	HCl 即用，内含：0.1M的HCl
3×	FOIL	粘性金属板

7、实验所需器材（但试剂盒不提供）

1）移液器（10；10-100；100-1000μL）

2）轨道摇床（200-900rpm）

3）旋涡混合器

4）带储器的8通道移液器

5）洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统

6）酶标仪

7）双蒸水或去离子水

8）吸水纸，取样吸头，计时器

9）样品稀释用试管。

8、手动操作

8.1实验前说明

注意	用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。
注意	试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。标准品无需稀释。

8.2样品的稀释

如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：

样品	待稀释	稀释液	备注
血浆	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	双蒸水	提取步骤前
尿液	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	0.1N的HCl	提取步骤前

8.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）

1）	将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液
3）	盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。
4）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
5）	每孔加入2ml双蒸水
6）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
7）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
8）	每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。
9）	在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板）
10）	快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
11）	每孔加入2ml双蒸水。
12）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
13）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
14）	每孔加入300μL Release缓冲液。
15）	在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板）

已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。

8.4冻干粉或浓缩成分的准备

稀释	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
25ml	洗涤液	225ml	双蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶联物	6ml	洗涤缓冲液（已稀释好）	1:101	临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		临时配置，仅能使用一次	18-25℃	5h

9、实验步骤（手动操作）

9.1 COMT酶溶液的准备

注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置

在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。

*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。

9.2样品、标准品和质控品的酶化

注意	如果使用自动置换型移液器，请将取样吸头内的残余液体加回到提取板相应的微孔内。将提取板置于一斜坡位置比较适当。

科研用组织匀浆和细胞培养上清可按如下建议处理：细胞培养上清必须根据其培养基及其相应浓度进行处理：根据尿液样品的操作说明（至少提取20ul上清液），未稀释样品的灵敏度大概为1.0ng/ml。如果基质内添加了血清（FCS），血浆（至少提取500ul上清）操作的灵敏度可以是5pg/ml。无高氯酸的组织匀浆可用做匀浆样品，具体信息请咨询IBL汉堡公司。

9.3检测尿液和血浆中的多巴氨

1	在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。
2	在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。将100ul提取好的血浆样品加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。
3	在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。
4	盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育120min
5	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。
6	在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。
7	盖板，在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育60min
8	移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。吸水纸上拍干以除去残余液体。
9	如果可以的话，使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。
10	在每一微孔中加入200ul底物液。
11	在振荡器（400-600rpm）上室温（18-25℃）温育40min
12	在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，轻轻振板以使溶液混合均匀。
13	加终止液后60min内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm）

10、自动操作步骤

10.1实验前说明

注意	用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行。下列所述体积为做48人份时所需要的量。
注意	试剂盒中的质控品和所有尿液样品在使用前都必须在试管中用0.1M的HCl按1：5的比例进行稀释（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。标准品无需稀释。

10.2样品的稀释

如果样品中多巴胺浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：

样品	待稀释	稀释液	备注
血浆	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	双蒸水	提取步骤前
尿液	多巴胺浓度高于最高标准品中多巴胺的浓度	0.1N的HCl	提取步骤前

10.3样品、标准品和质控品的提取（提取板）

1）	将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各30μL和750μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入750μL双蒸水以消除体积差别。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液
3）	盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。
4）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
5）	每孔加入2ml双蒸水
6）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
7）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
8）	每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。
9）	在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板）
10）	快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
11）	每孔加入2ml双蒸水。
12）	用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。
13）	移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。
14）	每孔加入450μL Release缓冲液。
15）	在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板）

已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。

10.4冻干粉或浓缩成分的准备

稀释	成分		稀释液	比例	备注	贮存	稳定性
25ml	洗涤液	450ml	双蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
150μL	酶联物	15ml	洗涤缓冲液（已稀释好）	1:101	临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		临时配置，仅能使用一次	18-25℃	5h

11、实验步骤（自动操作）

11.1 COMT酶溶液的准备

注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置

*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。

11.2实验步骤

在使用自动方法做实验时，我们建议按1：10的比例预先稀释提取好的标准品、质控品和尿液样品（如果是手动操作则用Release缓冲液进行稀释）。如果稀释了，第二个步骤可简化为：将已提取好的血浆样品、已提取好的标准品（按1：10的比例预先稀释）、质控品和尿液样品各100μL加入到微孔中。在进行预稀释时，应当考虑到自动操作的死容积。

1）在包被板的每一微孔中加入75μL刚配置好的COMT酶溶液，轻轻振荡。

2）在尿液样品、标准品和质控品的微孔中加入90μL Release缓冲液（血浆样品孔除外）。将已提取好的标准品、质控品和尿液样品分别10μL加入到相应的微孔中。在此加样步骤中，可直接将取样吸头伸入到COMT溶液中。溶液颜色变成粉色，轻轻振荡。

3）每孔中加入50μL多巴胺抗血清。

4）盖板。在振荡器（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育120min

5）弃取孔内反应液，每孔用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。

6）每孔加入100μL酶联物

7）盖板。在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育60min

8）弃取孔内反应液，用250-300μL已稀释好的洗涤液洗板6次。

9）加底物液和终止液时，其时间间隔应相同

10）每孔加入200μL底物液

11）在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下温育40min。如果自动操作时的温度超过25℃时，则应相应的将温育时间缩短至30min。

12）每孔加入50μL PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振荡包被板以充分混合试剂成分。

13）加终止液后60min之内405nm处读取OD值。（参考波长：620-650nm）

12、期望值

实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：

	尿液		血浆
	μg/d	nmol/d	pg/mL	nmol/L
多巴胺	＜600	＜3917	＜100	＜0.65

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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