环氧合酶-2 (COX-2) ELISA使用说明书
2011-11-28 来源:本站 点击次数:2264环氧合酶-2 (COX-2) ELISA说明书
环氧合酶-2 (COX-2)简介
COX是一种膜结合酶，负责花生烯酸氧化生成前列腺素G2（PGG2）以及随后PGG2转变为PHG2。这是各种前列腺素生成的第一步。COX至少有两种不同的亚型，组成表达型COX-1，和诱导型COX-2。COX-1行使着看家功能，如血管止血，肾流血量，肾小球功能维护。COX-2存在于部分细胞内，发出炎症信号，如生长因子，细胞因子和内毒素。
环氧合酶-2 (COX-2)实验原理
试剂盒采用夹心酶免法，采用了两种高特异性抗体，TMB作为着色剂，最终溶液所显示的颜色强度与样品中COX-2的量成正比
检测范围
1.09~70ng/mL
环氧合酶-2 (COX-2)预期用途
1. 试剂盒可用于细胞上清裂解液中人COX-2的检测
细胞培养液
1） 将细胞培养液（1x105~1x107个细胞）加入至0.5ml的IBL裂解液中（货号为#19022）
2） 在振荡器上混匀或用移液枪吹打混匀
3） 2-8℃下旋转30min使其溶解
4） 2-8℃，10000rpm下离心10min
5） 有必要的话用EIA缓冲液稀释上清液
2. 细胞裂解液试验中，建议所用细胞数应一致
3. 建议总蛋白浓度也同时检测，可检测到人COX-2与总蛋白的关系
环氧合酶-2 (COX-2)试剂盒组成
1. 微孔板，96孔，包被有抗人COX-2鼠IgG单抗
2. 酶标抗体浓缩液，30X，HRP标记的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml
3. 标准品，重组人COX-2，0.5mlx2
4. EIA缓冲液，30ml
5. 酶标抗体稀释液，内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液，12ml
6. 显色剂，TMB，15ml
7. 终止液，1N硫酸，12ml
8. 洗涤缓冲浓缩液，50ml，40X，0.05%吐温20的磷酸缓冲液
环氧合酶-2 (COX-2)操作指南
实验所需器材但试剂盒不提供
1. 酶标仪（450nm）
2. 微量移液器和取样吸头
3. 带刻度的量筒与烧杯
4. 蒸馏水
5. 温育器（37℃±1℃）
6. 冷床箱（4℃）
7. 坐标纸（log/log）
8. 吸水纸
9. 用于稀释标准品的试管
10. 洗涤瓶
11. 酶标抗体稀释的一次性试管
准备
1. 洗涤缓冲液制备：先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完
2. 标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。
例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体浓缩+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔加100ul）
此步骤在实验前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃
3. 标准品的制备：吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到140ng/ml的人COX-2标准品
4. 标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管 70 ng/ml
2号管 35ng/ml
3号管 17.5ng/ml
4号管 8.75ng/ml
5号管 4.38ng/ml
6号管 2.19ng/ml
7号管 1.09ng/ml
8号管 0pg/ml（试验样品空白）
吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为70~1.09ng/ml
5. 样品稀释：样品用EIA缓冲液稀释
实验步骤
使用前，所有样品应平衡至室温，大约30min，然后充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行
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试剂 |
检测样品 |
标准品 |
检测样品对照孔 |
试剂对照孔 |
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检测样品100ul |
稀释标准品（1-7管）100ul |
EIA缓冲液（第8管） 100ul |
EIA缓冲液100ul | |
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盖板，37℃下孵育60min | ||||
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洗板7次 | ||||
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酶标抗体 |
100ul |
100ul |
100ul |
- |
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盖板，4℃下孵育30min | ||||
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洗板9次 | ||||
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显色剂 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
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室温避光温育30min | ||||
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终止液 |
100ul |
100ul |
100ul |
100ul |
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加终止液后30min内450nm处读取OD值 | ||||
1. 确定好空白孔，并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
2. 确定好样品对照孔，检测样品孔和标准品孔，然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
3. 盖板，37℃孵育60min
4. 用洗瓶洗板，在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒，弃取洗涤液。重复7次，最后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时，用洗板机洗四次后，再用洗瓶洗3次。
5. 每孔加入100ul酶标抗体。
6. 盖板，4℃下温育30min
7. 按照步骤4）洗板9次
8. 将所需量的显色剂加入到试管中，然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染，请勿将剩余试剂倒入显色剂原装瓶中。
9. 室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10. 每孔中加入100ul终止液，此时溶液颜色会变成黄色。
11. 除去包被板孔底的杂质或水滴，同时确保液体表面无泡沫， 30min内在450处读取OD值。
特别注意
1. 样品采集后应立即检测，如需贮存的，则应放置在冰冻条件下，避免反复冻融，检测前应在低温下将其溶解并完全混合
2. 如有需要，样品可用EIA缓冲液稀释
3. 建议试验样品和标准品做双份检测
4. 试验样品应在中性PH范围内，有机溶剂的污染会影响试验
5. 只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板，洗板不充足可能会导致试验失败
6. 彻底倒去洗涤液，吸水纸上拍干，不能用吸水纸擦拭微孔
7. 底物液应避光保存，因其对光敏感，且要避免接触金属
8. 加入终止液后30min内读数
结果计算
绘制标准曲线前，将所有的检测孔（包括标准品和未知样品）的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上，以标准品的OD值（减去空白后的值）对其相应的浓度，通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。
典型标准曲线
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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