Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q
2012-03-16 来源:本站 点击次数:4003Real time PCR mRNA 定量实验路线选择F&Q
问题一：Real time PCR mRNA的相对定量和绝对定量的选择；
测定mRNA, 一般采用相对定量，因为绝对定量，标准品的制备和定量是有难度的，具体可以参考这篇文献：http://www.biotnt.com/news/news_105.htm；
“Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method”
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen
Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and †Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
问题二：Real time PCR 的染料法和探针法的选择；
答：进行mRNA表达量的测定，采用染料法是比较经济实惠的；染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况；目的基因和内参基因分管检测；
染料法可以选用Real time 染料PCR PreMIX，A2010A0112，A2010A0112-2，A2010A0112-3（http://www.biotnt.com/product/product_32252.html）
探针法主要应用于病毒RNA的检测；以及单位点突变（SNP）；多基因的合并检测；举例：
如果某mRNA 有多个亚型，很难找到一段扩增产物都一致的部分来设计引物，用探针法可以通过仅找到同源处设计引物和探针的方式，进行多基因的合并检测；但如果用染料法，可能得到的产物有多个，熔解曲线非单峰，检测的数据就很难看；这种情况，适用探针法；探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况；而染料法则必须分管检测。
探针法可以选用：热启动Taqman-PCR PreMix试剂盒（探针）A2010A0103（http://www.biotnt.com/product/product_32234.html）；
热启动Taqman-PCR探针法多重荧光Premix A2010A0114（http://www.biotnt.com/product/product_32240.html）
一步RT-Real time PCR 探针法Premix，A2010A0115s，A2010A0115L(http://www.biotnt.com/product/product_32242.html)
问题三：Real time PCR 相对定量中标准曲线法和deltadelta CT法的选择；
答：一般选择deltadelta CT法；当扩增效率相差比较大的时候，可以采用标准曲线法进行检测和计算；
问题四：Real time PCR 相对定量中的标准曲线法如何进行：
答：主要是相对定量标准品的制作，一般有三种方法：
1、比较复杂的方法：质粒
采用Biotnt 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），对目的基因进行real time PCR实验，得到PCR扩增产物；PCR 扩增产物转入质粒中，得到相对定量的标准品；
2、一般采用的方法1：比较强的CDNA 模板
采用Biotnt 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），对目的基因进行real time PCR实验，选择比较强的CDNA 模板，一般CT要在20-25之间，对这个CDNA 进行5倍的梯度稀释，一般稀释四到五个点；对梯度稀释的CDNA 进行real time PCR，以CT值为纵坐标，横坐标为CDNA 模板的相对浓度取对数，绘制标准曲线。
3、一般采用的方法：PCR 扩增产物
如果在方法2中找不到比较强的CDNA 模板，则选用PCR 产物作为相对定量的标准品也是可以的；需要注意的事项是：PCR 产物浓度很高，而real time PCR的产物片段比较短，容易在稀释的过程中造成PCR污染，要注意操作。
一般PCR 产物在稀释一万倍以后，作为模板加入1ul到体系中，这时候的CT在10个循环左右，所以建议对PCR模板一万倍的，做100倍稀释，建立标准曲线；
注：标准曲线一般要跨过您要检测的样本的CT，才能比较精确的进行定量；
标准品尽量分布在您样本CT的附近；所以，标准品的稀释倍数，不一定是要一样的；
问题五：Real time PCR mRNA相对定量中内参的选择；
答：一般选择beta-actin， GAPDH ，18sRNA 等相对丰度比较均一的基因作为内参基因；
也可以根据参考文献选择内参基因；
Biotnt 提供内参基因的特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html）
严格的选择内参基因的方式应该有如下步骤：
1、 针对您要检测的实验组选择部分有代表性样本；
2、 统一抽提RNA；
3、 测定RNA 含量；选择同一量的RNA去进行逆转录；
4、 确定备选的内参基因，准备内参基因的引物；得到最优体系；
5、 测定转录后的CDNA各个备选的内参基因的CT值；
6、 计算每个备选的内参基因的平均CT，SD 和CV；
7、 选择CV比较小的作为合格的内参基因；
8、 如果多个备选内参基因的CV都比较小，则您的实验对内参的影响就比较小；建议选择与您的目的基因CT相对比较接近的备选内参基因作为实验的内参基因。
问题六：Real time RT-PCR 中逆转录采用两步法还是一步法的选择；
答：
如果您同时要检测多个目的基因，通常建议您采用两步法，即先使用mRNA CDNA第一链合成试剂盒（http://www.biotnt.com/product/product_32249.html），得到CDNA; 然后采用Biotnt 荧光定量PCR Premix试剂盒(荧光染料)（http://www.biotnt.com/product/product_32252.html）和特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），进行多基因的同时检测，可以实验高通量和高效率；最多进行多基因的同时检测；最多可以在一块96孔板上进行48个基因的双重复检测；
如果您要检测的基因含量特别低，或者样本很难抽提，或者引物特别难设计，可以采用Real time RT-PCR 一步法的方案；即您抽提好的mRNA，采用一步RT-Real time PCR 染料法Premix A2010A0116L（http://www.biotnt.com/product/product_32244.html），和特异性real time PCR mRNA引物（custom primer pairs） （http://www.biotnt.com/product/product_32250.html），就可以进行real time PCR的mRNA 表达的相对定量研究；因为采用了特异性引物进行逆转录，提高的检测的特异性，消除了其他mRNA的干扰。
问题七：Real time RT-PCR 逆转录的引物，采用oligodT 还是随机引物，还是特异性引物的选择；
一般检测mRNA， 通常是采用的oligodT 作为逆转录引物；对于mRNA的逆转录，特异性比较高；
特异性引物可用于已知特定序列的mRNA，或者其他要检测的RNA（如病毒等），特异性最高；
随机引物可用于不知序列的总RNA的逆转录，特异性最低；
问题八：Biotnt的RNA 抽提是采用的什么原理？
答：Biotnt的RNA 抽提采用的是Trizol法；（http://www.biotnt.com/product/product_32245.html）。Trizol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等样本中提取总RNA。是如今实验室普通采用的方法。Biotnt 后期进行逆转录和real time PCR 实验所使用的RNA 无须进行额外的纯化。
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