扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示：C＝C0 (1+P)ⁿ 。其中：C为扩增产物量，C0 为起始DNA量， P为增效率， n为循环次数。

在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。

三、PCR产物的克隆

在许多研究中，需要将PCR产物克隆，以获得目的DNA片段。此时，所用PCR循环数应尽量小，以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。

1、 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。

2、在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点，可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT，使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP，ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键，保证在载体3'端只加上一个ddTTP，而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接，连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口，这种重组DNA仍可转化合适的受体菌，并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。

3、粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。

材料、设备及试剂

一、材料

不同来源的模板DNA。

二、设备

移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。

三、试剂：

1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.0， 1.0％ Triton X-100。
　　2、MgCl₂ ：25mmol/L。
　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
　　5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液。
　　6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
　　7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70％ 乙醇。

操作步骤

一、PCR反应

1、 依次混匀下列试剂

35μl H₂ O
　　5μl 10×PCR反应缓冲液
　　4μl 25mmol/L MgCl2
　　4μl 4种dNTP
　　0.5μl 上游引物（引物１）
　　0.5μl 下游引物（引物２）
　　0.5μl 模板DNA(约1ng)

混匀后离心5秒。

2、将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3、 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

二、电泳

取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。

（一）酚/氯仿法

1、取反应产物加100μl TE.。
　　2、加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
　　3、再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
　　4、在水相中加300μl 95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。
　　5、在小离心机上10000rpm离心10min，吸净上清液。加入1ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH₂O 中，待用。

（二）Wizard PCR DNA纯化系统

Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：
　　50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
　　5ml 直接提取缓冲液
　　50支 Wizard微型柱

1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
　　2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
　　3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
　　4、取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
　　5、将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
　　6、取出微型柱置于eppendorf管中，12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
　　7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。
　　8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。

[注意]

1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
　　2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。

四、载体加dT尾

1、将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
　　2、在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。
　　3、加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。
　　4、按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
　　5、加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1hr。
　　6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体粘末端连接

1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。
　　2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
　　3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1、 在50ml的PCR产物中，直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。
　　2、 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
　　3、 用酚:氯仿抽提2次。
　　4、乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
　　5、 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml （约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。
　　6、取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

[注意]

1、PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
　　2、吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
　　3、加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
　　4、应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。