中药材黄曲霉素检测技术概述

2014-02-12 来源:北京泰乐祺科技有限公司点击次数:4887

一、 中药材质量安全现状

中药材是中医防病治病的重要基础。中药材在田间生长、采收加工、储藏运输等各个环节都会因污染霉菌而发生霉变。这些霉菌分泌的有毒代谢产物使中药材发霉变质，直接威胁到群众的用药安全。中药中的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏马毒素等。中药材的种类是影响真菌毒素污染的主要因素,易污染的中药材,在不同的温、湿度条件下均可产生真菌毒素。温度和湿度条件也可以影响真菌毒素的增长,如：黄曲霉毒素在不同的温、湿度条件下均可以产生；赭曲霉毒素需要在湿度较高的条件下才能产生。

近年来,随着中药材在国际市场上的持续升温,其安全性越来越引起人们的关注。真菌毒素残留作为中药材微量外源性有毒有害物质,一般不表现出急性毒性,但通常有较强的蓄积性,致癌、致畸、致突变作用明显,严重影响中药材的安全性。

二、 中药材真菌毒素控制相关国家法规

近年来，各级食品药品监管部门不断加大中药监管力度，努力保持中药质量总体稳定。

国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知（国食药监安[2012]187号文件）中，要求加强对黄曲霉毒素、重金属及有害元素、农药残留量等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。

《国家药品安全“十二五”规划》，规划中明确指出“开展药品快速检验技术研究，搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”，“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。

三、 中药材真菌毒素检测项目及限量标准

国家食品药品监督管理局对柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为“黄曲霉毒素B1不得过5 μg/kg；黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得过10 μg/kg”。

2010 版《药典》附录IX V 黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。

四、 中药材黄曲霉素检测方案介绍

（一） 仪器分析法

特点

优点	缺点
准确、灵敏、抗干扰性强，国家检测部门的确证方法。	仪器成本高、对操作人员技术要求高、操作复杂、耗时较长。

免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合2010版《药典》附录IX V中黄曲霉毒素测定高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。

1. 设备和耗材配置　　

序号	品名	规格及参数	数量	用途
1	高效液相色谱仪		一台	分析检测
2	荧光检测器		一台	读取荧光信号
3	Pribolab真菌毒素专用色谱柱	150/250mm 货号：PRC-18	一支	配套各类色谱仪，霉菌毒素检测用
4	PriboFast®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱	3ml，25支/盒，快速过柱型，货号：IAC-011-3	若干	高特异性，纯化样本
5	PriboFast®KRC光化学柱后衍生反应装置	货号：EQ-KRC	一台	适用于黄曲霉毒素检测
6	高速均质器	达到22000rpm 以上，货号：EQ-WR-1L	一台	耐腐蚀，高速，均质
7	PriboFast®玻璃纤维滤纸	100P,110mm，1.5μm 货号：GMF-110	一盒	霉菌毒素专用过滤
8	PriboFast®八位泵流操作架	货号：EQ-PUMP-8	一台	用于控制免疫亲和柱过柱流速
9	黄曲霉毒素混标	2µg/ml黄曲霉毒素B1, G1;0.5µg/ml黄曲霉毒素B2;G2 (4/1/4/1)溶于乙腈, 货号：STD#1081	1ml	用于定量分析标准品的配制

2. 样品前处理:普瑞邦为中药材提供不同的处理方案(详细方案请联系普瑞邦，普瑞邦开发了针对多种中药材基质提供优化的处理方案)

3. 免疫亲和柱净化:

富集--洗涤--洗脱--收集全部洗脱液供化学衍生检测用。

4. 化学衍生

为什么使用光化学衍生器？由于黄曲霉具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，因此可以进行HPLC-紫外或荧光检测，但是同时黄曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流动相中容易产生荧光淬灭，因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在线的，由于在线的柱后光化学衍生有明显的优势，所以现在被增补为药典的检测方法，优势主要在于无需任何化学试剂、对人员无伤害；无需人员直接操作、避免误差; 无需担心衍生液腐蚀检测器。

5. 高效液相色谱分析

PriboFast KRC光化学衍生器  波长：254 nm
HPLC-色谱柱 ：黄曲霉毒素专用C-18色谱柱   150 x 4.6 mm;
流动相 ：甲醇-水 45:55
流速 ： 1.0 mL/min

柱温 ： 35 °C
进样体积： 20μL
荧光检测器：λ-激发波长：365nm λ-发射波长：455 nm

HPLC配置；高效液相色谱仪带有荧光检测器；黄曲霉毒素专用色谱柱 C18 150 x 4.6 mm

（二）酶联免疫法

特点

优点	缺点
灵敏度高、耗时较短、样本处理比较简单、对技术人员要求不高、检测成本低、可同时检测大批量样本。适用于大量样本快速定量筛查。	可能存在一定假阳性率（交叉反应率）。

Pribolab(普瑞邦)推出的PriboFast^R黄曲霉毒素总量试剂盒具有较高的灵敏度和准确度，适用于大量样本的定量分析。

1. 方法原理

采用直接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本（或黄曲霉毒素标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素特异抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合酶标抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素总量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素总量的含量。

2. 设备和试剂配置：

序号	品名	规格及参数	数量	用途
1	PriboFast^R黄曲霉毒素总量试剂盒	96T，灵敏度：0.1ppb 货号：EKT-011	一盒	定量分析检测
2	PriboSpin离心小柱	25T	一盒	净化样本
3	酶标仪（酶联免疫检测仪）	滤光片：450nm	一台	配套各类色谱仪，霉菌毒素检测用

3. 样本前处理：中药材：粉碎、提取、离心，取上清液加入PriboSpin离心小柱进行净化。

为什么要用PriboSpin离心小柱？中药材的基质复杂，提取时样本液颜色较深，而且不容易去除。有机试剂提取净化方法繁琐，试剂挥发对环境及人体造成危害，且净化效果不稳定。用PriboSpin离心小柱，则只需提取液离心过柱，即可去除提取液中的杂质，方便快捷，净化效果好，且回收率可以达到85%以上。

4. 检测步骤

4.1 免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酶标仪读OD值。

5. 分析结果的表述

用酶标仪判读结果。

（三）免疫金标快速检测法

特点

优点	缺点
操作简单、费用低廉、耗时短、检测快速。适用于样本快速定性初步筛查	存在一定假阳性、数据不方便保存及分析。

Pribolab(普瑞邦)推出的PriboStrip^TM黄曲霉毒素总量免疫金标快速检测条特异性好，适用于检测样本量大；短时间出具检测结果并控制经费的情况，可以快速定性，初筛。

1. 方法原理

黄曲霉毒素总量快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的黄曲霉毒素总量在酶标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲霉毒素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上AF－BSA偶联物的结合。如果样本中黄曲霉素总含量大于0.5 ug/L，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。

2. 设备和试剂配置

序号	品名	规格及参数	数量	用途
1	PriboStrip^TM黄曲霉毒素总量免疫金标快速检测条	25T 检测限：10ppb 货号：PR-011	一盒	定性分析检测

3. 分析步骤：中药材粉碎溶解后取上清液检测。吸取样品滴加到加样孔中，8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下：T 线显色比C线深或一样深是阴性。T 线显色比C线浅，或无显色是阳性结果。

五、 温馨TIPS：

1. 中药中真菌生长繁殖的有利条件主要是适宜的温度与水分。如能将中药贮存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。

2. 从事真菌毒素科研及检测的人员，必须注意防护，如穿戴隔离衣帽，在进行真菌分离培养工作时，应戴口罩，并尽量防止孢子飞扬。

3. 操作台面如有漏溅，应立即用新配的5％次氯酸钠消毒。以5％次氯酸钠（NaOCl）处理时，黄曲霉毒素于数秒钟内即被破坏，故是常用的消毒剂。

4. 也有应用生物学方法解毒的报道，生物学方法成本低，收效大，可能是一种有前途的除毒措施。

鉴于霉菌毒素对人体的危害，提醒各位奋斗在抗毒一线的老师们一定要注意保护自身安全哦！

关于Pribolab®（普瑞邦）

Pribolab®（普瑞邦）是面向全球提供霉菌毒素检测解决方案的主要服务商之一，凭借强大的研发团队和专业的霉菌毒素检测技术的研究，为全球农业生产、食品加工与粮食、饲料工业等行业提供专业的霉菌毒素检测技术与产品服务，同时为社会提供食品、饲料及饮料等的霉菌毒素、食品成分等检测分析。

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