作者：张坤博士 徕卡显微系统 生命科学部 应用专员

如何免除活细胞标记中的清洗（washout）步骤？

SNAP-tag等标记方法为活细胞显微成像带来了革命性的变化，也因此被Nature杂志评为2004年最热门的科研技术之一。但是传统的SNAP-tag标记仍然有很大的缺陷。将带有荧光探针的底物BG加入细胞后需要多次清洗细胞，才能将未结合的BG去除从而消除背景荧光对成像的影响。即不能实时在底物与SNAP-tag结合的过程中，跟踪SNAP-tag融合蛋白的动态变化。YasuteruU等科学家基于SNAP-tag研发了一种荧光偶联性激活标记方法（fluorescenceactivation-coupled protein labeling, FAPL），通过改造SNAP-tag的底物来解决这一问题，从而能够实时的记录细胞内一些动态的生命过程，如蛋白表达、定位、转运及降解等过程[13-15]。在Snap-tag底物BG鸟嘌呤的C-8位置引入一个淬灭基团，可以有效的通过荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)或光诱导电子转移（Photoinduced electron transfer，PET）吸收BG上标记的荧光基团荧光能量，使其在与SNAP-tag结合之前是不会发出荧光的。一旦底物与SNAP-tag结合，该淬灭基团就会解离下来，荧光基团将发出荧光（图4）。因此荧光信号只有在SNAP-tag融合蛋白上才会被点燃，所以也就不再需要任何的清洗步骤。Utrano及其同事已经成功的将这种标记方法应用于研究细胞运动中表皮生长因子受体（EGFR）相关的膜运输过程（图5）[13]。

图3.HEK293活细胞中ATTO647N和Chromeo494分别标记的EGF和EGFR的STED超高分辨率成像。由图E、F、K、L可以看出，STED对EGFR-EGR复合体的成像分辨率比共聚焦提高了3~4倍。

图4. 传统的SNAP-tag标记方法与基于FAPL的SNAP-tag标记方法比较

图5.EGFR在细胞中转运的实时记录。（a）示意图，用于解释如何利用FAPL探针来实时追踪EGFR相关的细胞膜转运过程。（b）COS7细胞中表达的EGFR用DRBG-488标记（绿色），溶酶体用lysosometracker（红色）标记。（c）对表达SNAP-EGFR–CFP的MDCK细胞进行共聚焦实时成像。SNAP-EGFR-CFP用DRBG-488进行标记。在5min时加入了EGF刺激细胞，每个1min拍摄一次荧光图像。相对于CFP的成像，DRBG-488能够更清楚的记录EGF刺激之后囊泡的形成及其在溶酶体里的聚集。

为了能够消除自发荧光，更清楚的对更深的组织甚至是活体动物进行荧光成像，科学家们对近红外染料的研发从未止步过[16]。Johnsson等科学家最近基于sillion-rhodamine荧光基团，推出了一款新的细胞膜通透性的近红外染料（SiR）[17]。在未与SNAP-tag等标签结合之前，成聚集状或者与疏水结构非特异性结合的SiR会处于不发荧光的螺甾内酯状态；一旦与标签蛋白结合，SiR将处于两性离子状态，而发出很强的荧光（图6）。将SNAP-tag的底物标记SiR便形成了SiR-SNAP。因此，利用SiR-SNAP对活细胞进行标记时，背景荧光非常低，从而免除了清洗步骤，实现实时的荧光探测。同时由于其光谱的近红外特性，可以应用于深层组织，如大脑切片的成像（图7）。

图6. （A）SiR的两种形式。（B）SiR的激发光谱（蓝色虚线）和发射光谱（红色实线）。

图7. SiR-SNAP标记的大鼠脑片。a,子宫内原位电转示意图。红色方框内的区域即为b图中进行荧光成像的区域。b,通过子宫内原位电转将SNAP和GFP的质粒以1:1的比例导入到E16期的神经元前体细胞中。对E19期的大鼠脑组织进行了切片并用SiR-SNAP和Hoechst进行了染色。c,对b图中黄色方框区域的放大，GFP和SiR-SNAP的良好共定位验证了SiR-SNAP标记的特异性。

SiR在STED超高分辨率显微成像中的应用

Johnsson及其同事也将SiR-SNAP应用到STED超高分辨率显微镜对中心体蛋白Cep41的活细胞成像中[17]（图8）。共聚焦图像显示SiR-SNAP标记的U2OS细胞中的Cep41-SNAP在微管及中心体中均有定位（图8b）。STED超高分辨率显微镜发现SNAP-Cep41以环形排列在中心体上，该环形的直径为175±13nm （n=7），这说明Cep41定位于微管形成的中心粒壁上（图8d）。Z轴方向成像显示由SNAP-Cep41形成的结构大约长440±28nm （n=16），这与已经报道的中心粒的长度是一致的，这说明Cep41形成的环形结构贯穿于整个中心粒。

图8. U2OS活细胞中Cep41的共聚焦及STED成像。a, 中心体结构示意图。b,SiR-SNAP标记的Cep41和Hoechest 33342标记的细胞核的双色共聚焦图像。c,结合于微管的Cep41的共聚焦及STED荧光图像。d,位于中心体的Cep41的共聚焦及STED荧光图像。标尺，500nm。

细胞骨架如微管、微丝等一直是生命科学研究的重点。近期Johnsson等科学家将SiR直接标记于与微管和微丝分别特异性结合的小分子docetaxel和jasplakinolide，即形成SiR-tubulin和SiR-actin，实现了在不对细胞或组织进行任何转染或基因组修饰的条件下直接进行活细胞成像[18]（图9）。SiR-tubulin和SiR-actin仍然保留了SiR的优良特性，非常适用于STED成像（图10）。SiR-tubulin标记人成纤维活细胞中的微管后, STED超高分辨率显微镜揭示了细胞质中及中心体上tubulin的定位及结构信息。在这种标记和成像方法下，细胞质中微管的粗细测量为39±10 nm, 这是目前活细胞中微管成像的最高分辨率。STED成像也清晰的揭示了中心体上的微管以9个亚复合体排布成直径约176±10 nm的环形（图10a，b），两个临近亚复合体之间的夹角成39°±13°（图10c），这些数据与之前用电子显微镜研究得到的数据是一致的[19]。SiR-actin标记活的大鼠海马区原代神经元后，STED超高分辨率显微镜揭示了微丝在轴突上以181±20 nm的区间成周期性排布（图10d-f），这与之前用固定的样品得到的结果是一致的[20]。这些数据充分说明了SiR-actin和SiR-tubulin在活细胞超高分辨率显微镜成像中使用的便捷性及可靠性。目前SiR-tubulin和SiR-actin已经被Spipochrome公司商品化，使用方法也有非常详细的描述。

图9. SiR-tubulin和SiR-actin。a, SiR-tubulin和SiR-actin的分子结构。b，SiR-tubulin和SiR-actin只有在分别结合了微管或微丝后才能发出荧光。c，SiR-tubulin和SiR-actin标记的人成纤维细胞，结构照明成像，标尺，5 mm。

图10. SiR-tubulin和SiR-actin标记的活细胞的STED成像。（a）人成纤维活细胞中心体上微管的STED代表性图像(已经过Richardson-lucy反卷积运算)。（b）人和小鼠的中心粒的直径。（c）人和小鼠中心粒中临近的两个微管亚复合体之间夹角。（d）16天的大鼠海马区元代神经元在用SiR-actin染色后的STED原始图像。（e-f）微丝在神经元轴突上以间隔为181±20 nm的距离成周期性分布。

总结

新的荧光探针和成像技术的发展，极大地加快了生命科学探索的步伐，并将继续为细胞生命活动提供极其重要的新见解。近十年中，超高分辨率和单分子显微镜发展迅速并越来越成熟化，可以预见在不就的将来利用超高分辨率显微镜对活细胞进行成像将成为非常常规的科研手段。作为在这个方向迈出的一步，各种各样的新型活细胞标记方法和荧光探针的研发也得到了越来越多的科学家的青睐和重视。总体来说，SNAP-tag等标签标记方法已经在活细胞系统的研究和操控中显示出极大的潜力。而SiR等新型染料的研发必将进一步推进超高分辨率显微镜在活细胞成像中的应用。

参考文献

13.Komatsu, T., Johnsson, K., Okuno, H.,Bito, H., Inoue, T., Nagano, T., and Urano, Y. (2011). Real-time measurementsof protein dynamics using fluorescence activation-coupled protein labelingmethod. J Am Chem Soc 133, 6745-6751.

14.Sun, X., Zhang, A., Baker, B., Sun, L.,Howard, A., Buswell, J., Maurel, D., Masharina, A., Johnsson, K., Noren, C.J.,et al. (2011). Development of SNAP-tag fluorogenic probes for wash-freefluorescence imaging. Chembiochem 12,2217-2226.

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18.Lukinavicius, G., Reymond, L., D'Este,E., Masharina, A., Gottfert, F., Ta, H., Guther, A., Fournier, M., Rizzo, S.,Waldmann, H., et al. (2014). Fluorogenic probes for live-cell imaging of thecytoskeleton. Nat Methods 11,731-733.

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