动态浊度法鲎试剂使用说明介绍

2015-04-24 来源:上海北诺生物科技有限公司点击次数:3444

一、概述

鲎试验是一种最灵敏和专一的细菌内毒素检查方法，它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，通常称为细菌内毒素(热原)，与TAL反应可形成易于分辨的凝胶。简单、经济的鲎试验使得它已广泛应用于注射药品、生物制品、血液制品、医疗器械和环境中的细菌内毒素检测。

细菌内毒素与TAL反应混合物逐渐变浑浊，细菌内毒素浓度越高浊度变化越快，浊度变化符合二阶反应动力学曲线。借助仪器（注：如我国天津大学无线电厂BET-32C细菌内毒素测定仪。）进行动态比浊法试验，可精确地检测出已设定的浊度。细菌内毒素浓度与反应时间分别取对数后，将两组数据用最小二乘法统计，可以得到直线：

lgT=a+blgC

我们把这条直线称为标准曲线。未知检品中的内毒素水平是通过与标准曲线的比较来确定的。

二、鲎试剂

定量法鲎试剂完全不同于凝胶法鲎试剂，它对鲎血细胞提取物的纯度、溶解度、溶解后的澄明度以及在空气中其本身色泽稳定性都有较高要求。定量法鲎试剂的标识值λ表示定量鲎试剂的最低检测限，而不是灵敏度，是参考美国标准内毒素EC-5标定的，用EU/ml标示（如：湛江海洋生物制品厂生产的海浪牌定量法鲎试剂。）。

三、复溶

复溶前轻弹试剂瓶使瓶中的鲎试剂粉末落到瓶底，小心地打开试剂瓶盖，避免接触污染，残留在试剂瓶盖上的少量试剂无关紧要。在使用前按标识量复溶试剂，不立即使用时用无热原封口膜封住瓶口，轻轻转动试剂瓶直到鲎试剂完全溶解。如果封口破损或溶解时出现颜色或混浊则将其丢弃。

四、贮存

冻干的定量法鲎试剂在常温条件下还是相对稳定的，但还是应存放在20℃下；避免长时间放置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好将其存放在-20℃以下冻结，仅可能在7天内使用，鲎试剂只能冻融一次。

五、警告

正确应用该检测方法要求严格遵守操作规程中的所有项目，样品定量试验必须包括回收试验以验证回收率的合格条件。所有与样品接触的试验材料必须无内毒素，玻璃器皿必须经有效除内毒素。

六、产品干扰

每一样品的检测方法必须经过验证证明无明显的干扰，干扰通常与浓度有关，可用LAL检查用水稀释来克服干扰。

七、最大有效稀释

中国药典2000年版规定经静脉给药的药品的内毒素阈值为5EU/kg.hr，鞘内药品为0.2EU/kg.hr。对于一些简单的药品也采用特殊限值，这些限值可以用来确定稀释的范围以克服干扰问题而不会超过限定的内毒素浓度，最大有效稀释倍数（MVD）是按照文件和药典中提供的公式来计算的：

MVD＝内毒素限值×产品效价/最低检测限

例如，头孢曲松钠（2.0mg/支）的内毒素限值是0.20EU/mg，如湛江海洋生物制品厂定量法鲎试剂030329最低检测限为0.005EU/ml。首先用5ml检查用水溶解头孢曲松钠，产品效价＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml。

MVD＝内毒素限值×产品效价/最低检测限

＝0.20EU/mg×0.4mg/ml/0.005EU/ml

＝16倍

八、日常检查

标准曲线应包括至少三个内毒素浓度，重复两管检测，例如10，1.0和0.1EU/ml。对于半成品或原材料的检测，从10至0.01EU/ml的四个数量级的标准曲线可能更合适。使用三次检测的标准曲线，当标准曲线具有较好的一致性时，可储存标准曲线；若使用储存标准曲线，阳性对照误差必须在±10%以内。做回收率试验时，样品阳性对照管应含有等于标准曲线中点的内毒素浓度，例如上面介绍的1.0EU/ml。

九、结果

在整个检测过程中，细菌内毒素测定仪每隔10秒自动监测吸光度的增加，仪器详细记录每一时间对应的浊度值，浊度0.02值对应的这一时间称为临界时间。细菌内毒素测定仪软件自动将每一标准品的临界时间与它相应的内毒素浓度的对数值进行回归计算得到标准曲线，然后显示标准曲线的特征并评估确定该标准曲线是否有效。

BET-32 标准曲线分析

鲎试剂：030329 生产：湛江海洋生物制品厂内毒素：2002-12

试管	样品名称	批号	稀释倍数	外加内毒素	反应时间	变异系数	回首率	实测内毒素（EU/ml）
1	阴性对照			0	>7200			0
2	阴性对照			0	>7200
3	内毒素标准			10	457	3.32%		9.6748
4	内毒素标准			10	479
5	内毒素标准			1．0	753	0.65%		1.0655
6	内毒素标准			1．0	760
7	内毒素标准			0．1	1285	1.11%		0.0969
8	内毒素标准			0．1	1265
9	内毒素标准			0．01	1925	0.05%		0.0100
10	内毒素标准			0．01	1915
11	注射用棓丙酯	030709	0.5mg/ml	0	>3600	0		0
12	注射用棓丙酯	030709	0.5mg/ml	0	>3600
13	注射用棓丙酯	030709	0.5mg/ml	1.0	735	1.80%	116%	1.1658
14	注射用棓丙酯	030709	0.5mg/ml	1.0	748

回归等式：LogT=2.8849-0.2176LogC