导言

成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始，这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核，产生诸多效应：

1、 T细胞克隆的扩增

2、 细胞表面活化标志的上调

3、 分化成效应性细胞

4、 诱导细胞毒或细胞因子的分泌

5、 诱导凋亡

最常用的体外刺激检测 T细胞增殖的方法是用 TCR的抗原或竞争性抗体活化 T细胞。

本 protocol 是一个基本方法，用 CD3 体外刺激小鼠脾 T 细胞和人类外周血 T细胞的增殖，关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。

一、 小鼠：

用包被的 145-2C11单抗刺激小鼠T细胞；MTT法测细胞增殖

材料

1X 无菌 PBS

Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)

RPMI-1640 完全培养基

无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液

96 孔平底带盖微孔板

MTT Buffer

MTT裂解液

刀豆蛋白 A，可选 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)

仪器用具

微量移液器或排枪

离心机

37°C, CO2培养箱

96孔板读板机

实验时间

2小时包被抗体

20分钟制备脾脏单细胞悬液

20分钟分析设置

2-4天孵育

实验步骤

抗体包被至微孔板：

1、 用无菌 PBS 制备 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品做复孔。例如，包被半张板需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时，CD3 抗体的浓度可以降低。

2、 每孔加入 50μl 抗体，空白对照孔加 50μl 无菌 PBS。

3、 用ParafilmTM膜将板封好，37℃孵育 2 小时或 4℃过夜。

4、 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。

5、 每孔用 200μl 无菌 PBS 洗后，弃去 PBS。

6、 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。

加细胞：

1、 取脾脏，无菌制备单细胞悬液。溶血去除红细胞。

2、 计数细胞并重悬于RPMI-1640 完全培养基中，浓度为 106/ml。根据实验需要可选择 2-3x106/ml～105/ml的浓度。

3、 洗板结束后，每孔加 200μl 细胞悬液，置于潮湿的 37°C, 5% CO2 培养箱中。可选择加刺激对照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。

4、 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培养箱中孵育 4 小时。

6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，轻轻振荡并孵育过夜。

7、 第二天 570nm 读板。

8、 计算平均值和标准方差，作图。

二、 人：

用 CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）；MTT 法检测细胞增殖。

材料

1X 无菌 PBS

Anti-human CD3:

Clone OKT3 (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0037) or Clone HIT3a (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0039)

RPMI-1640 完全培养基

无菌 PBMC

96孔平底带盖微孔板

MTT Buffer

MTT 裂解液

仪器用具

微量移液器或排枪

离心机

37°C, CO2 培养箱

96 孔板读板机

实验时间

30 分钟制备 PBMCs

20 分钟设置分析

2-4 天孵育

实验步骤

1、 制备PBMCs并重悬于RPMI完全培养基中，浓度 1-2x106/ml。可根据实验调整细胞浓度至 2-3x106/ml～105/ml。

2、 每孔加 100μl 细胞悬液，每种样品做复孔。

3、 每孔加 100μl 可溶性抗体，优化抗体浓度。若使用分离的 T 细胞做增殖分析，推荐用 10μg/ml 抗体包被在 96 孔板上进行刺激。

4、 放置于潮湿的 37°C, 5% CO2 培养箱中。

5、 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

6、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培养箱中孵育 4 小时。

7、 每孔加 50μl MTT 裂解液，轻轻振荡并孵育过夜。

8、 第二天 570nm 读板。

9、 计算平均值和标准方差，作图。

缓冲液和培养基

RPMI-1640 完全培养基：

900ml RPMI-1640

热灭活的 100ml FBS（10%终浓度）

1ml 2-巯基乙醇

10ml L-谷氨酸盐

抗生素混合物（可选）

MTT Buffer：

MTT 贮存液：溶于 1X PBS，浓度为 5mg/ml，避光保存

MTT 裂解液：

20% SDS 50% DMF

相关产品