摘要
γ丁内脂（γ-butyrolactone简称GBL）生物合成基因afsA和GBL受体基因arpA的两对同系物位于吸水链霉菌基因组的不同位置。井冈霉素是一种重要的抗菌抗生素，同时也是抗糖尿病药物合成的关键底物。抑制afsA能够使急剧降低井冈霉素的生物合成，删除arp同系物能够分别增加井冈霉素的产率26%（ΔshbR1）和20%（ΔshbR3）。shbR1/R3同时突变导致adpA-H(S. hygroscopicus ortholog of the global regulatory gene adpA)以及井冈霉素的转录水平升高，井冈霉素产量能提高55%。通过串联删除GBL受体基因设计高产量工业菌株，井冈霉素的产量从19g/L增加到24g/L （%26），产率从6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1（45%），这是以前从未报道过的。该研究文章发表在《METABOLIC ENGINEERING》杂志，影响因子6.767。
该研究中RNA测序Analyzer IIx (Illumina)技术测序服务由上海伯豪生物提供完成。

研究背景
链霉菌属是抗生素以及农业、医疗应用中有生物活性的次级代谢物获取的丰富资源。通过调控放线菌属所在的环境以及生理条件能够减少转录抑制、增加转录活性从而提高目的次级代谢物的产量。GBL调控系统在放线菌次级代谢调控中非常重要，至少60%放线菌都会产生GBLs。其中A-factor作为一种GBL其调控机制已经为广泛研究。三个关键蛋白AfsA，ArpA和AdpA构成了A-factor级联调控系统。当A-factor达到一定水平会绑定到受体蛋白ArpA上，进而启动抗生素合成。井冈霉素是由吸水链霉菌5008产生的一种重要的农用抗生素，而且是抗糖尿病药物底物α-葡萄糖苷酶抑制剂（voglibos）重要合成来源。因此理解井冈霉素生物合成和发酵调控被广泛研究。但是设计调控井冈霉素生物合成的研究却比较缺乏。之前已有研究报道了吸水链霉菌5008的基因组，以及基因组上的三对同系物afsA-arpA以及adpA。也有研究阐明了adpA同系物的作用。但是afsA和arpA同系物的调控作用以及afsA在次级代谢中的作用还并不知道。

研究结果

1. 链霉菌属中多对同系物afsA及arpA共存

通过对19种链霉菌全基因组序列比对研究，发现有7中链霉菌都有多对afsA-arpA同系物存在（Fig 1）。说明在多种链霉菌中存在多个afsA-arpA同系物共存是普遍现象。在吸水链霉菌5008基因组上有三对afsA-arpA同系物，作者对发酵过程中的多个时间点监测了shbAs和shbRs的转录水平，发现相邻的shbAs和shbRs同系物对有相似的转录模式，然而在不同的shbAs-shbRs对之间转录模式却是不同的（Fig 2A）。AdpA在A-factor集成调控中起着中心作用，通过对adpA同系物研究，发现在12到84小时中其转录水平并无显著差异（Fig 2B）。

2. afsA及arpA同系物参与井冈霉素生物合成

分别删除afsA以及arpA同系物。shbA1失活导致井冈霉素产量下降超过90%；ShbA2和shbA3失活分别导致产量下降77%和61%（Fig 3A）。ΔshbR1和ΔshbR3能够显著增加井冈霉素的产量分别为26%和20%。ShbR2删除井冈霉素产量无显著改变。以上结果说明删除arpA（shbR1和shbR3）同系物能够提高井冈霉素生物合成，而删除afsA同系物能抑制其合成。

3. ShbR1通过双向调控机制抑制adpA-H转录

接下来作者研究了ShbR1对adpA-H转录的调控作用。ShbR1突变24h时adpA-H转录水平显著上调（Fig 4A）。EMSA实验表明ShbR1能够绑定adpA-H启动子区域（Fig 4B）。以上结果表明ShbR1能够通过直接绑定adpA-H启动子来抑制其转录。删除shbR1 48小时前，shbR3转录水平显著下调（Fig 4C）。EMSA实验还显示shbR1也能够结合到shbR3和shbA3的基因间区（Fig 4D）。shbR1可能能够通过结合到shbR3启动子正向调控shbR3。ShbR1能够通过直接作用和间接作用抑制adpA转录。

4. 共同失活shbR1/R3能增加井冈霉素产量

通过对野生型以及shbR突变菌株发酵随时间变化进行观测，发现发酵后期，井冈霉素产量和产率在shbR1/shbR3共同突变时相对野生型增加55%和95%（Fig 5A）。井冈霉素终产量也在shbR1/shbR3共同突变比分别突变shbR1和shbR3显著提高。shbR1突变和shbR1/R3共同突变时，相比野生型，细胞增长在发酵48小时后下降（Fig 5B）。同时shbR1/R3共同突变时，adpA-H和valABC转录水平比野生型或者shbR1单独突变时高（Fig 5CD）。
以上结果表明同时删除shbR1/shbR3能够完全抑制adpA-H转录，增加井冈霉素产量。

5. 同时突变后转录分析

为了研究shbR1/shbR3缺失对细胞代谢的影响，本研究采用RNA测序对野生型以及shbR1/shbR3同时突变菌株进行转录的比较分析。shbR1/shbR3同时突变菌株有559个突变基因，其中158个基因上调，401基因下调。结果如预期的一样，很多参与次级代谢的基因在都呈现上调趋势，如井冈霉素基因簇SHJG0271–SHJG0285（Table 1）。功能富集分析结果说明shbR1/shbR3失活能影响整个细胞代谢，包括次级代谢物合成，中心碳代谢，细胞外水化酶分泌以及转运系统。

6. 通过串联删除GBL受体基因设计高产菌株提高井冈霉素产量

同时删除高产量工程菌S. hygroscopicus TL01的shbR1和shbR3基因，结果如Fig 6A，TL01细胞生长并无统计学显著性。在double-mutated TL01 (TL-DM)中,井冈霉素产量增加了26%，达到24 g/L (Fig. 6B)。此外，工程菌株产率在48h发酵产率从6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1，比之前报道的7gL-1 d-1显著提高。此外，井冈霉亚基胺（井冈霉素的中间产物）的产量也显著增加51%（Fig 6C）。

研究结论

该研究阐述了多对afsA-arpA同系物参与调控井冈霉素生物合成，ShbR3能够直接抑制adpA-H转录，ShbR1能够抑制直接绑定adpA-H启动子区域直接抑制adpA-H转录，也可通过正调控shbR3间接抑制adpA-H转录。同时失活ShbR1和ShbR3解除adpA-H阻遏，进而增加井冈霉素产量。该研究对于设计个体高产菌株提高井冈霉素产量以及理解多afsA-arpA同系物共存在调控机制有重要意义。

原文出处
Gao-Yi Tan, Yao Peng, Chenyang Lu, Linquan Bai, Jian-JiangZhong. Engineering validamycin production by tandem deletion of r-butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008. Metabolic Engineering Volume 28, March 2015, Pages 74–81.