由于将一个新药带入市场的成本非常高，药物公司能够开发的药物数量就会受到限制。为此，在药物研发的早期，大多使用复杂的筛选技术来剔除那些没有潜力的候选药物。若要成功，必须对代谢物和杂质的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（简称ADME/Tox）做出快速和准确的评估来表征先导化合物。杂质样品的高通量分析对低浓度样品，尤其是生物基质中的低浓度样品提出了挑战。各种可能的修饰作用使数据解释进一步复杂化。Finnigan LCQ 系列离子阱质谱仪具有高灵敏度、高选择性和复杂数据相关等操作性能，能很好的适应于药物中杂质分析的需求。在组合化学研究中能够快速采集、解析和分析结构数据，对化合物筛选工作的顺利进行是至关重要的。Mass Frontier，是热电用于解析和处理质谱图数据的高级软件包，配置该软件包，能够对所提供分子结构的碎裂途径给出预测。在本文的研究中，使用了碎裂和机理模块来确定一个先导药物关键中间体的三个杂质的结构。

 

对一个先导药物的关键中间体的杂质的化学结构作结构鉴定。

 

用于分析的药物样品由Eisai 研究所提供。所有实验在Finnigan LCQ 离子阱质谱仪上采用APCI 模式完成。使用Finnigan SurveyorTM 液相色谱仪和AQUASIL C18 （250×2 mm）色谱柱完成液相色谱分离分析。液相色谱条件：40％水和60％乙腈的流动相,等梯度洗脱，流速为300ul/ml，不分流（进入质谱）。

Finnigan LCQ 质谱仪的离子源参数如下：

 

电离模式: 正离子，APCI

加热毛细管温度：175°C

蒸发温度：325°

CAPCI 电流：5μA

鞘气压力：80 个单位

辅助气压力：20 个单位

 

Mass Frontier 软件提供了专为提高质谱图解析速度而设计的高级分析工具包。作为八个模块其中之一的碎裂和机理模块，能够根据用户提供的化学结构自动预测碎片途径和反应机理。基于模拟单分子离子离解反应的算法，碎裂和机理模块包含了针对电子轰击电离、质子化反应和化学电离等已知的反应机理。

 

碎裂和机理模块的主要功能是：

● 核查所提供的化学结构与实验得到的质谱图之间的相关性

● 确认谱库检索给出的结果

● 识别在质谱图中最相关化合物的结构差异

 

此外，碎裂和机理模块可以模拟二级质谱实验。当用户输入指定化合物结构，就会生成一系列理论碎片离子，与二级质谱实验数据进行比较。在本研究中，对假设化学结构模拟产生的碎片离子与数据相关二级质谱实验观察到的子离子进行关联分析，确认了先导药物关键中间体中三个痕量杂质的结构。

 

对一个先导药物关键中间体的最近流程评价，Eisai 研究所认为在开始下一步工作前对这些中间体杂质结构的深入分析是必要的。由于产权原因，图1 仅给出了这个化合物的部分结构。注射20μL（含100ng/μL 的药物中间体和其杂质）样品到色谱系统，洗脱分离

 

 

图 1. 关键药物中间体的部分结构图

 

后进入质谱仪中检测。LCQ 质谱仪采用了数据相关二级质谱扫描模式，在这个模式下，一次运行分析就可以采集到全扫描质谱和二级质谱数据，而不需要预先指定二级质谱的母离子质量数。

 

图2a 给出了分析的总离子流图。药物中间体在质荷比m/z486处有很强的信号，对应保留时间是8.5 分钟。另外观察到背景离子（与样品不相关）m/z 391，392 和393。从总离子流图中扣除这些背景离子后，得到三个杂质m/z 分别为 538, 488 和556 的色谱图（见图2b）。根据质量数差异和同位素分布图，推断三个杂质为在药物中间体的双键上分别添加了ClOH，H2，和 Cl2（在图1 中以红色标记）。

 

 

图 2.（a）保留时间在8.5分钟的药物中间体（m/z 486）的全扫描总离子流图（b）扣除背景（m/z391, 392, and393）和药物中间体（m/z486和487）后的低浓度杂质（m/z538, 488 和556）离子流图

 

图 3 为三个杂质的推断结构，图 4 为三个杂质测得的同位素分布和推断结构同位素分布的比较，图5 为药物中间体和三个杂质的提取离子色谱图。两个含氯杂质的信号强度是未修饰中间体的0.1％。由于仪器灵敏度和信噪比高，四个化合物可在一次数据相关的二级质谱实验被检测到。动态排除是数据相关采集的又一个特点，低含量成分即使在和高强度成分共同洗脱时，也能够采集其二级质谱数据，这种功能适合低含量杂质分析的要求。

 

 

如果没有动态排除功能，就采集不到二氢杂质的二级质谱数据，因为与二氢杂质共同洗脱的未修饰中间体的强度更高。在二级质谱数据扫描中，排除列表中包括了m/z 391,392, 和393 的离子，以避免背景离子的二级质谱分析。由于使用数据相关采集数据，就不需要在方法中输入指定二级质谱扫描的母离子质量数。这样就避免了先进行全扫描实验，然后手动查找二级质谱扫描需要的母离子质量数。对于低浓度成分分析，这个过程费时且造成实验失误。图6 中，在与碎裂和机理模块预测结果进行比较前后，Mass Frontier 谱图管理窗口可以显示采集到的药物中间体的二级质谱数据。特别是输入药物中间体化学结构后，软件就使用已知的单分子离解反应模式来预测可能生成的二级质谱碎片离子。然后这些理论预测的二级质谱碎片离子与实验数据进行匹配分析。图6 为程序给出的所有的主要二级质谱碎片峰，证明了碎裂和机理算法对给定化学结构二级质谱预测的有效性。

 

 

图7 为与预测的碎片离子相比较后的三个杂质的实验二级质谱图。Mass Frontier 的预测是基于图3 中三个杂质推断的结构给出的。和图6 一样，如预测的碎片离子和实验二级质谱中的离子匹配用红色标记。可以看到，实验得到的二级质谱的所有主要离子都被红色标记，这有力支持了所推断结构的有效性。表1 汇总了Mass Frontier 软件预测碎片结构和实验二级质谱的相关性结果，来验证图3 推断的杂质结构。为了理解如何获得到这样的结果，必须意识到除了取代发生的位置（图1 和图3 红色标识），所提议的药物中间体结构和三个杂质结构是相似的。因此，如果实验得到的四个化合物的二级质谱中，每个化合物都有特定的碎片离子，而Mass Frontier 预测能给出相同的裂解机理，那么所提议的三个杂质结构就是正确的：

 

● 如果Mass Frontier 软件预测碎裂机理生成的碎片结构不包含取代位，那么在实验得到的四个二级质谱图中应有相同质荷比的碎片离子。

● 如果Mass Frontier 软件预测碎裂机理生成的碎片结构包含了取代位（即如果实验得到的二级质谱图中药物中间体的碎片离子的质荷比为M，那么在二氢，氯羟基，二氯取代杂质分别应该有M+2, M+52 和M+70 质荷比值），那么碎片离子的质荷比应存在取代基质量数的差异。

 

在表1，Mass Frontier 软件指定具有相同裂解机理的碎片离子被以相同颜色加重。这样可以从表中看出，在所有情况下，由Mass Frontier 预测形成机理得到的有关联的碎片离子要么有相同的实验质荷比，要么有与取代基差异的实验质荷比，这依赖于Mass Frontier 预测的碎片结构是否有取代位。通过观察证明了所推断的杂质结构的有效性。

 

在数据相关二级质谱模式和动态排除的支持下，检测和表征了含量在0.1％或以下的专利药物中间体的三个杂质。同位素分布和质量差说明了推断结构的合理性，并由Mass Frontier 所验证。通过Mass Frontier 预测碎片离子和实验得到的二级质谱图离子的比较，确定了所建议的三个杂质结构。该分析支持以下的结论：三个杂质都来自于药物中间体某双键位置的化学取代。

 

● 所要分析的杂质含量是母体成分丰度的0.1％以下，这是法规所要求的。Finnigan LCQ 离子阱质谱仪具有高灵敏度和高选择性，数据相关扫描模式，是成功完成杂质分析的必备工具。

● Mass Frontier 谱图管理和碎裂机理模块技术能够快速方便地完成结构分析，并能对推断的杂质结构予以确认。

 

药物杂质分析解决方案--离子阱多级液质