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dek35编码PPR蛋白影响玉米籽粒的线粒体nad4基因内含子1的顺式剪接和发育

2017-02-23     来源:本站     点击次数:3949

农林RNA测序助力玉米籽粒dek35突变体研究

该研究与前几天RNA测序在玉米籽粒dek2突变体中分子机制的研究应用相似,研究的主角依然是上海大学生命科学学院,该工作主要由陈鑫泽博士完成。研究对象由dek2突变体变为了dek35突变体。

研究思路

研究结果

dek35突变表现出发育迟缓的表型

本研究中dek35突变来源于美国玉米种质中心,编号为5605F。其表现出小籽粒,并且顶部种皮中空(图1)。突变体百粒重只有野生型20%(dek2是35%)(图1)。总淀粉、直链淀粉和总储藏蛋白含量没有显著变化,醇溶蛋白在突变体中显著下降。亚细胞层面观察发现,胚乳转移层细胞(BETL)在突变体中发育迟缓,表明籽粒发育受到抑制(图1)。

dek35基因克隆

研究人员对dek35突变体进行图位克隆,将其定位于玉米1号染色体254,244,136 bp to 289,337,516 bp大约35M区段内。由于该突变来源于Mutator突变系,研究人员怀疑其可能含有Mu的插入(图2)。对其进行Mu标签分离表明,一个Mu标签存在于35M的区段内,插入在了GRMZM2G066749起始密码子下游30bp处。该结果同样通过等位测试验证(图2)。

dek35编码了一个P-type PPR蛋白

研究人员通过将GRMZM2G066749蛋白编码序列在数据库中比对后发现,该基因编码了一个P-type PPR蛋白(图2)。

dek35在籽粒发育过程中持续性表达

研究人员通过定量PCR以及Western Blot杂交发现,dek35是一个全组织表达的基因(图3)。

dek35定位于线粒体中

将dek35连接入荧光表达载体,使其与黄色荧光蛋白YFP融合,并对其共聚焦显微镜亚细胞定位研究。结果发现,dek35定位于线粒体内嵴(图4)。

dek35影响nad4内含子1的剪切

由于PPR蛋白可以与对应的线粒体或者叶绿体RNA互作,因此研究人员对dek35突变体胚乳以及野生型胚乳的线粒体转录本进行了分析。研究人员使用特异的引物扩增了线粒体cDNA,在35个基因中,只有nad4的成熟转录本在dek35中显著下降(图5)。进一步研究发现,nad4内含子1在dek35中显著下降导致了全长成熟转录本表达量下降。

dek35影响了线粒体复合物I的聚集

为了深入研究线粒体的呼吸复合物,研究人员分离了dek35 线粒体蛋白并且进行了非变性的BN-PAGE电泳。电泳结果显示,复合物I含量显著下降(图6)。该结果证明了nad4内含子1的剪切影响导致了复合物I功能的下降(图7)。


dek35影响了线粒体的正常功能

研究人员为了对dek35在籽粒发育过程中的作用有全局性的了解,分别选取了的dek35胚乳以及野生型胚乳进行了RNA转录组测序(RNA-Seq服务由伯豪生物提供)。经过数据分析,一共筛选到了4720个差异基因,其中632个基因具有功能注释。在GO归类后,研究人员发现,这些基因主要聚集于mitochondrial inner membrane (GO:0005743, P-value=2.2E-07), ATP synthesis coupled proton transport (GO:0015986, P-value=0.00043), protein targeting to mitochondrion (GO:0006626, P-value=2.0E-05) and cytochrome-c oxidase activity (GO:0004129, P-value=0.0024) (图8)。

dek35突变体线粒体形态变化显著

为了对dek35突变体线粒体有深入的表型观察,研究人员最后还通过透射电镜观察了突变体与野生型的表型变化。结果发现,突变体的线粒体呈现畸形的表型(图9)。

研究结论

dek35与dek2同样编码了一个定位于线粒体的P-type PPR蛋白。dek35突变导致了显著的该基因蛋白水平的下降,降低了对nad4内含子1剪切效率(dek2是降低nad1内含子1的剪切效率)。对dek35突变体线粒体复合物的分析发现,dek35未成熟籽粒表现出了复合物I显著的缺失以及NADH脱氢酶活性显著下降。对dek35突变体籽粒进行转录组测序发现,呼吸相关基因表达量显著升高,线粒体功能相关基因表达量变化显著。该结果表明dek35突变体是一个新的PPR蛋白影响了线粒体nad4内含子1的顺势剪切。并且对籽粒发育至关重要。

原文出处:Chen X, Feng F, Qi W, Xu L, Yao D, Wang Q, Song R. Dek35 Encodes a PPR Protein that Affects cis-Splicing of Mitochondrial nad4 Intron 1 and SeedDevelopment in Maize. Mol Plant. 2016.

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