基本方案

从小鼠脾脏、胸腺和淋巴结制备单个核细胞分离和培养。

实验材料
1.RPMI-5或DMEM-5完全培养基。
2.新鲜分离的小鼠器官：≤6周龄的小鼠胸腺；6周至6个月龄的小鼠脾脏和淋巴结。
3.60mm×15mm培养皿。
4.剪刀和镊子（保存在70%乙醇的烧杯中）。
5.装有19G针头的6ml注射器。
6.200μm尼龙滤网。
 
实验方法
1.将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMI-5或DMEM-5完全培养基的60mm×15mm培养皿（每种器官一个培养皿）中，用剪刀将器官剪碎。
2.用6ml注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直至仅剩纤维组织。
3.用装有19G针头的6ml注射器将组织悬液反复抽吸数次，以进一步粉碎组织团块。
4.将细胞悬液通过200μm尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml完全培养基洗一次培养皿，如需要则重复一次，之后将洗液通过滤网加入离心管中。
5.在Sorvall H-1000B离心机中以1000r/min（200g）离心10min后弃上清（如需要去除红细胞和死细胞，见辅助方案）。用20ml完全培养基将沉淀重悬后离心，再以适量培养基重悬以便计数。
6.如细胞不能立即处理，最好的保存细胞活力的方法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失。
 
附录：
RPMI-5完全培养基：
RPMI1640培养基（Life Technologies）
5%FBS, 56℃热灭活1h
10mmol/L HEPES
20μg/ml 硫酸庆大霉素
50μmol/L 2-ME
过滤除菌

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