体液黄嘌呤氧化酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI体液黄嘌呤氧化酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过黄嘌呤氧化酶和过氧化酶酶偶联反应系统中生成的过氧化氢，与显色染料作用后，产生醌亚胺产物所呈现的吸光峰值的变化，即采用比色法来测定体液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体体液样品（血液、精液、脑脊液、尿液等）黄嘌呤氧化酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase；XO；EC1.17.3.2），又称为黄嘌呤氧化还原酶（xanthine oxidoreductase）是复合钼酸黄素酶（molybdoflavoenzyme），是人体中嘌呤分解代谢过程中的终端酶，存在于所有生命体中。在哺乳动物中，主要在肝脏和小肠高度表达。黄嘌呤氧化酶是一个单分子多元素构成的大分子结构体，分子量为270KD，含有2个黄素分子、2个钼原子、8个铁原子，参与呼吸链电子传递。黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤的羟基化作用，产生黄嘌呤（xanthine），进而氧化为尿酸（uric acid）。此外，黄嘌呤氧化酶可以作为NADH氧化酶，产生超氧阴离子和过氧化氢，影响各种细胞分子成分，导致细胞退化和死亡，以及心血管疾病。肝病患者的肝组织中黄嘌呤氧化酶活性1000倍高于正常人水平。黄嘌呤氧化酶缺陷将引起黄嘌呤尿（xanthinuria），导致肾衰竭。基于底物次黄嘌呤（hypoxanthine），在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）的催化下，生成过氧化氢，然后借助过氧化酶（peroxidase）的作用，与对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反应，形成有色醌亚胺（quinoneimine），通过其吸收峰值的变化（510nm波长），来定量分析黄嘌呤氧化酶的活性。其反应系统为：

产品内容

YIJI缓冲液（Reagent A） 毫升

YIJI底物液（Reagent B）      毫升

YIJI反应液（Reagent C）      毫升

YIJI阴性液（Reagent D）   微升

产品说明书    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；有效保证6月

用户自备

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品处理

培养箱：用于反应孵育

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

选择一：血浆样品

• 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品 

• 准备好1.5毫升离心管
• 移取1毫升液体到离心管 
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长510nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；YIJI缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

• 样品测定

• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数） 

五、计算样品活性

• 酶标板测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent A）到96孔板中
• 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent C）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent D）或待测样品（50微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数
• 活性计算：

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要
• 加样后3秒内比色测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 黄嘌呤氧化酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够转化1微摩尔黄嘌呤至尿酸所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列氧化酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感