叶绿素荧光技术发展历程及测量原理
2017-10-13 来源:本站 点击次数:3721叶绿素荧光，作为光合作用研究的探针，得到了广泛的研究和应用。叶绿素荧光不仅能反映光能吸收、激发能传递和光化学反应等光合作用的原初反应过程，而且与电子传递、质子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等过程有关。几乎所有光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来，而荧光测定技术不需破碎细胞，不伤害生物体，因此通过研究叶绿素荧光来间接研究光合作用的变化是一种简便、快捷、可靠的方法。目前，叶绿素荧光在光合作用、植物胁迫生理学、水生生物学、海洋学和遥感等方面得到了广泛的应用。
发展历史
叶绿素荧光现象是由传教士Brewster首次发现的。1834年Brewster发现，当一束强太阳光穿过月桂叶子的乙醇提取液时，溶液的颜色变成了绿色的互补色——红色，而且颜色随溶液的厚度而变化，这是历史上对叶绿素荧光及其重吸收现象的首次记载。后来，Stokes（1852）认识到这是一种光发射现象，并使用了“fluorescence”一词。1874年，Müller发现叶绿素溶液稀释后，荧光强度比活体叶子的荧光强得多。尽管Müller提出叶绿素荧光和光合作用之间可能存在相反的关系，但由于他的实验没有对照，实验条件控制不严格，因此人们并没有将叶绿素荧光诱导（瞬变）现象的发现归功于Müller。
Kautsky是公认的叶绿素荧光诱导现象的发现者。1931年，Kautsky和Hirsch用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象(Lichtenthaler，1992；Govindjee，1995)。他们将暗适应的叶子照光后，发现叶绿素荧光强度随时间而变化，并与CO2的固定有关（图3.1）。他们得到的主要结论如下：1）叶绿素荧光迅速升高到最高点，然后下降，最终达到一稳定状态，整个过程在几分钟内完成。2）曲线的上升反映了光合作用的原初光化学反应，不受温度（0℃和30℃）和HCN处理的影响。若在最高点时关掉光，则荧光迅速下降。3）荧光强度的变化与CO2的固定呈相反的关系，若荧光强度下降，则CO2固定增加。这说明当荧光强度降低时，较多的光能用于转变成化学能。4）奇怪的是（照光后）CO2的固定有一个延滞期，似乎说明“光依赖”的过程对CO2固定过程的进行是必需的。另一个未得到解释的现象是若在荧光诱导结束后关掉光，则荧光水平的恢复需要很长时间。在Kautsky的发现之后，人们对叶绿素荧光诱导现象进行了广泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用荧光诱导理论，被广泛应用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出贡献，叶绿素荧光诱导现象也被称为Kautsky效应（Kautsky Effect）。
量子产量
细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子或间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后，从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。由于波长越短能量越高，故叶绿素分子吸收红光后，电子跃迁到最低激发态；吸收蓝光后，电子跃迁到比吸收红光更高的能级（较高激发态）。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，在几百飞秒（fs，1 fs=10－15 s）内，通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图3.2）。最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒（ns，1 ns=10－9 s）。
处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态。能量的释放方式有如下几种（图3.3）（Campbell et al.，1998；Roháček & Barták，1999；Malkin & Niyogi，2000）：1）重新放出一个光子，回到基态，即产生荧光。由于部分激发能在放出荧光光子之前以热的形式逸散掉了，因此荧光的波长比吸收光的波长长，叶绿素荧光一般位于红光区。2）不放出光子，直接以热的形式耗散掉（非辐射能量耗散）。3）将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶绿素分子，能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后到达反应中心，反应中心叶绿素分子通过电荷分离将能量传递给电子受体，从而进行光化学反应。以上这3个过程是相互竞争的，往往是具有最大速率的过程处于支配地位。对许多色素分子来说，荧光发生在纳秒级，而光化学发生在ps级，因此当光合生物处于正常的生理状态时，天线色素吸收的光能绝大部分用来进行光化学反应，荧光只占很小的一部分。
活体细胞内由于激发能从叶绿素b到叶绿素a的传递几乎达到100%的效率，因此检测不到叶绿素b荧光。在室温下，绝大部分（约90%）的活体叶绿素荧光来自PSⅡ的天线色素系统，而且光合器官吸收的能量只有约3%～5%用于产生荧光（林世青，1996；Krause & Weis，1991）。
饱和脉冲技术工作原理
所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PS II释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多，F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。
打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，F达到最大值。
经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。
在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm’。根据Fm’和F可以求出在照光条件下PSII反应中心部分关闭的情况下的实际原初光能捕获效率=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的实际光合效率。
在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于关闭态，实时荧光F比Fm要低，也就是说发生了荧光淬灭（quenching）。植物吸收的光能只有3条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1=光合作用+叶绿素荧光+热。可以得出：叶绿素荧光=1－光合作用－热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemical quenching, qP）；由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。
光照状态下打开饱和脉冲时，电子门被完全关闭，光合作用被暂时抑制，也就是说光化学淬灭被全部抑制，但此时荧光值还是比Fm低，也就是说还存在荧光淬灭，这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭。淬灭系数的计算公式为：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。
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