一、简介

靶向细胞的科研研究和药物研发避免不了细胞活力的分析和追踪。但依据实验的最终目的和关注参数的不同，细胞活力的体现，检测方法也会不一样。例如细胞增殖检测适用于比较不同细胞株增殖能力，而细胞毒性分析则可以用于探究候选药物是否有细胞毒性等。从分析仪器上来说，现阶段主流的检测平台，如显微镜，流式细胞仪和实时荧光定量pcr仪等都可用于细胞活力的分析，但不同的平台所关注的指标，灵敏度和通量会有所差异，因此需要依据所回答的生物学问题和指标选择合适的检测平台。在上述平台中，酶标仪提供了96、384孔板的高通量细胞活力检测方法，灵敏度上能和经典的[3H]胸腺嘧啶掺入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美，因此成为了主流的科研和工业研发中细胞活力和毒性分析平台。相应的，细胞活力分析也成为了酶标仪的基础应用之一，也是Molecular Devices (MD)关注的主要应用。

 

在本手册中，我们会从酶标仪出发向大家介绍，对比主流的细胞活力，毒性分析方法，并通过详细的应用材料向大家展示如何应用MD酶标仪和软件轻松，专业的完成细胞活力，毒性分析。
 

 

二、细胞活力分析

此部分主要关注常见的细胞活力分析方法，如MTT和ATP法等。虽然这些检测方法也常用于分析药物毒性和安全性，但相较于乳酸脱氢酶细胞毒性检测等方法，它们更关注细胞活力的变化。依据原理的不同，细胞活力检测方法主要分代谢法，酶活法和ATP法。

 

2.1 代谢法

2.1.1原理和介绍

代谢法是最常见的细胞增殖检测方法，其主要包括四氮唑还原法(Tetrazolium reduction)，如MTT和CCK-8法等，和刃天青还原法(Resazurin Reduction)，如alamarBlue法等。这些方法的原理都是基于细胞的代谢能力还原孵育的底物，其产物通常具有光吸收或荧光属性，因此能用酶标仪进行高通量细胞活力分析。

 

上述方法中，最常见的是MTT法，其属于酶标仪光吸收应用，利用细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶对MTT的还原，形成不溶于水的结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中和细胞外。最后使用特定的有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)等溶解后进行 570 nm处检测[图一]。由于MTT本身具有正电荷，因此容易进入细胞，并具有一定的代谢毒性。同时，确切上说，MTT法是检测细胞线粒体的代谢活力。

图一，MTT法原理，图片来源于https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

 

近年来在MTT的基础上一系列类似结构的底物被应用于细胞增殖活力检测中，主要包括MTS, XTT, 和WST等，它们同样属于酶标仪光吸收应用。与MTT不同，这些底物本身具有负电荷，因此不易进入细胞，同时其还原产物可溶于水，因此无需溶解结晶步骤，提升了实验的操作性和稳定性。该系列中，最常见的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相较于仅依赖线粒体脱氢酶的MTT法，CCK-8法基于细胞内多数的脱氢酶，因此其检测活力更为准确，灵敏度更高，同时降低了细胞毒性[图二]。由于省去了溶解步骤，CCK-8法支持动力学检测，提高了实验的灵活性。同时因其毒性低，细胞在完成CCK-8法检测后还可以用于后续的其他检测。

图二，CCK-8法原理，图片来源于

 

上述的代谢法均属于酶标仪光吸收应用，虽然相对经济，但还是会受到光吸收本身的多种限制，尤其是动态范围窄，容易受到具有光吸收特性的试剂和药物干扰等。同时，光吸收法受限于比尔定律中的光径因素，不适用于384或1536孔板等更高通量检测等。因此，基于荧光检测的代谢法也成为了主要的细胞活力检测方法之一，其中常见的是基于刃天青还原的alamarBlue法。

 

原理上alamarBlue法与MTT和CCK-8法类似，利用增殖中的细胞固有的代谢能力进行还原无色，无荧光的刃天青，所得的红色产物resorufin具有强荧光特性，因此可用支持荧光或光吸收的酶标仪进行检测，提升了检测的灵活性和抗干扰能力[图三]。支持荧光检测的alamarBlue法可具有3-4个动态数量级，具有更宽的检测范围和更高的灵敏度。同时，还原产物可溶于水，低毒，因此和CCK-8一样支持动力学检测和多重检测。然而，alamarBlue法更为稳定，因此非常适合追踪细胞的增殖变化。

 

图三，alamarBlue反应前后的荧光(左，530-560 nm 激发)和光吸收变化(右)，图片来自于Invitrogen 技术材料

 

2.1.2 Molecular Devices的支持

针对于代谢法MD主要提供硬件和软件的支持，其中，硬件上配备光吸收的单功能和多功能酶标仪，如cMAX plus，Spectra-Max M系列等都支持MTT法和CCK-8法的高通量检测。对应的，具有荧光检测功能的酶标仪，如SpectraMax iD3/5，SpectraMax Gemini EM，SpectraMax i3X和M系列都推荐用于荧光法细胞活力检测。软件上，一方面Softmax Pro 7 模板库中的Cell Growth &Viability已经预设了一些常用的方法模板，如alamarBlue法和MTS法。类似的方法只需在预设的模板上改变检测参数即可，同时，修改后的模板可另存为新的模板方便后续的检测。另外一方面，软件支持多种形式的数据处理，包括双波长矫正，空白扣除，数据均一化到后期的线性、四参数拟合等等，极大的简便了分析过程，提高分析效率和一致性。

 

2.1.3 常见实验流程和注意事项

代谢法的实验流程基本一致，以MTT法为例[图五]，主要分为以下几个步骤。

a) 预铺细胞于96孔板中，细胞密度需要根据细胞系本身和实验目的(增殖活力还是药物毒性筛选)进行优化。一般来说，悬浮细胞的密度要高于贴壁细胞。板型上光吸收法推荐透明板，荧光法推荐黑边底部透明板。

b) 按照需求进行化合物或类似处理，此步的实验需要优化药物的起始处理时间和孵育时间，留意代谢法需要细胞代谢加入的底物，因此需要维持细胞在增殖阶段进行下一步染色。此步中还需要留意对照的选择和设置，包括系统对照（只有细胞或只有MTT染料加药物等）和阳性对照(细胞毒实验中溶剂处理组等)。

c) 进行底物孵育，此步需要优化底物孵育的时间和浓度。留意荧光法此步注意避光。

d) 溶解反应出的结晶，此步需要确保结晶的完全溶解，同时要确保溶解产物不影响最后的检测，通常酸化的溶解会避免酚红对最后检测带来的影响。CCK-8法和alamarBlue法无需此步

e) 应用酶标仪进行单波长或者双波长检测。一般MTT法单波长为570 nm，双波长为 570 nm-630~690 nm 检测，用于矫正细胞碎片或浊度干扰[图五]。如果是荧光法，则按照推荐参数进行荧光检测。CCK-8法和alamarBlue法此步可按需求进行动力学检测。在进行动力学检测时，推荐酶标仪先预热至37°C。

处理和分析结果，相关的双波长矫正，均一化和线性/四参数拟合等可在Softmax Pro软件中自行完成。

 

代谢法的底物都是通过还原反应进行检测，因此会受到具有还原能力的化合物和试剂的影响。此外，具有光吸收属性和荧光属性的化合物可能会影响光吸收法，如MTT法和CCK-8法和荧光法如alamarBlue法的检测结果。对于上述影响，一方面可以通过直接混合化合物和底物检测排除，一方面可通过其他的细胞活力检测方法进一步分析。

2.2 酶法

2.2.1 原理和介绍

2.2.2 Molecular Devices的支持

2.2.3 常见实验流程和注意事项

2.3 ATP法

2.3.1 原理和介绍

2.3.2 Molecular Devices的支持

2.3.3 常见实验流程和注意事项

 

三、细胞毒性和杀伤分析

虽然上述的细胞活力分析方法被广泛的用于毒性分析，但其从细胞活性的变化为出发点，不是直接的分析细胞毒性，同时，随着免疫领域的兴起，越来越多的研究开始关注直接的细胞毒性，尤其是细胞裂解情况的检测。在此章中，我们会像大家介绍一些常见的，偏向由免疫细胞杀伤对应的毒性的检测。

 

3.1 LDH 细胞毒性法

3.2 Calcein 释放法

3.3 荧光素酶释放法