提取高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA对土壤微生物多样性研究至关重要。然而，土壤是一个非常复杂的异质体系，其中含有的腐植酸及腐植酸类似物、酚类化合物、重金属离子等，在DNA提取过程中如不能有效去除，将直接影响后续的PCR扩增、核酸杂交、内切酶消化等分子操作。

用传统微生物学方法对复杂微生物生态系统进行研究必须首先进行微生物的分离培养。由于土壤微生物生态系统极为复杂及培养条件的限制，可在实验室培养的微生物还不到土壤微生物总数的1％，相当多的微生物因无法人工培养而未被认识^[1]。

土壤微生物DNA的提取纯化是一个耗时、繁琐的过程，许多学者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。20世纪80年代中期以来，微生物学家开始采用免培养分子微生物生态学法直接对土壤微生物进行研究^[2]，其方法必须提取土壤微生物群落的DNA。Volossiouk^[3]等使用液氮研磨及SDS(十二烷基磺酸钠)破解微生物细胞提取土壤DNA，Tsai^[4]等则采用溶菌酶和SDS法提取土壤DNA，而这些方法所提取的DNA杂质较多，严重影响后续研究结果^[5-6]。后来，Bourrain等^[7]从活性污泥中以及LaMontagne等^[8]从堆肥中提取了微生物群落的DNA。但是，目前仍然没有一种快速、高效、低成本且高质量的土壤DNA提取方法。本文购买了市面上常用的土壤DNA试剂盒，就提取效果进行了对比。

 

用于DNA提取的土壤样品采自无锡市惠山区惠山中央公园草坪的贫瘠土(1～10 cm表土；样品编号1)、池塘边的活性污泥（样品编号2），以及小树林的腐殖土(1～10 cm表土；样品编号3)。

 

 

设置三个实验组：
（A）O公司 （Lot. M****-02）；
（B）M公司 （Lot.***545）；
（C）Bioteke （货号：AU46212）。

 

严格按照试剂盒步骤提取土壤DNA，比较不同试剂盒处理的DNA提取效率，并通过凝胶电泳和PCR扩增分别确定不同试剂盒提取后DNA的提取量及扩增16S rRNA基因的可行性。

 

用细菌通用引物对27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' PCR扩增不同处理后提取的土壤和活性污泥微生物群落中的16S rRNA基因。PCR循环为：94℃，3 min，1次循环；94℃，30 s，30次循环；55℃，30 s，30次循环；72℃，1 min，30次循环；72℃，5 min，1次循环。

 

 

表1土壤基因组DNA超微量分光光度计检测结果

图1土壤基因组DNA电泳图

 

图2 土壤样品16S rRNA基因PCR扩增产品电泳图

 

 

1.A组提取的DNA盐度尚可，但是含有的PCR干扰因子较多，PCR扩增不出条带；
2. B组三种土壤有提取的核酸只有两种满足PCR条件；
3.C组土壤提取试剂盒提取的土壤DNA，盐残留少，纯度高，提取的DNA中PCR抑制因子低，提取出的DNA可正常扩增，条带单一且清晰。

 

 

[1]Torsvik V L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems[J]. Current Opinion in Microbiology, 2002, 5(3):240-245.

[2]Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial Evolution, Diversity, and Ecology: A Decade of Ribosomal RNA Analysis of Uncultivated Microorganisms[J]. Microbial Ecology, 1998, 35(1):1-21.

[3]Volossiouk T, Robb E J, Nazar R N. Direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms.[J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(11):3972-3976.

4]Tsai Y L, Olson B H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments.[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1991, 57(4):1070-4.

[5] Bürgmann H, Pesaro M, Widmer F, et al. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil[J]. J Microbiol Methods, 2001, 45(1):7-20.

[6]王啸波, 唐玉秋, 王金华,等. 环境样品中DNA的分离纯化和文库构建[J]. 微生物学报, 2001, 41(2):133-140.

[7]Bourrain M, Achouak W, Urbain V, et al. DNA Extraction from Activated Sludges[J]. Current Microbiology, 1999, 38(6):315-319.

[8]Lamontagne M G, Jr M F, Holden P A, et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis.[J]. Journal of Microbiological Methods, 2002, 49(3):255-264.