一起学习多种细胞快速检测的方法吧
2019-07-19 来源:本站 点击次数:3687
小编前阵子去学了CPR，第一个步骤就是要先确认倒在那里的人是不是还…活着。
“先生先生，你怎么了?”（拍拍肩膀）
让小编开始好奇，我的细胞“要怎么判断他们是死是活呢？它们活的好吗?”
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使额外添加的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，死细胞则无此现象。接着用二甲基亚砜（DMSO）溶解沉积在细胞中的甲瓒后，可利用酶标仪490nm波长测光吸收值，依据吸光值（OD值）计算出活细胞数量。在一定细胞数范围内，吸光值与细胞活性成正比（下图1）。
“先生先生，你怎么了?”（拍拍肩膀）
我们可以简单将分析细胞活力和增殖测定的方法分成5大类：
1. 代谢增殖测定
2. DNA合成增殖试验
3. 化学发光细胞活性测定
4. 荧光染料增殖试验
5. 台盼蓝细胞计数
以下简单介绍这些分类的几种常见实验方式吧！（所有图片可点击放大）
代谢增殖测定
MTT检测法
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使额外添加的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，死细胞则无此现象。接着用二甲基亚砜（DMSO）溶解沉积在细胞中的甲瓒后，可利用酶标仪490nm波长测光吸收值，依据吸光值（OD值）计算出活细胞数量。在一定细胞数范围内，吸光值与细胞活性成正比（下图1）。
∆ 图1
XTT检测法
与MTT原理相似，皆是利用添加物与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应，并利用酶标仪测定产物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法还原产物是水溶性的橙黄色甲肷，不需经过二甲基亚砜（DMSO）溶解步骤，即可直接测定光吸收值（BI，货号：20-300-1000），操作较MTT方便快速。当XTT与电子耦合剂作用后产生的水溶性甲肷吸光值与活细胞数成正比（下图2）。
与MTT原理相似，皆是利用添加物与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应，并利用酶标仪测定产物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法还原产物是水溶性的橙黄色甲肷，不需经过二甲基亚砜（DMSO）溶解步骤，即可直接测定光吸收值（BI，货号：20-300-1000），操作较MTT方便快速。当XTT与电子耦合剂作用后产生的水溶性甲肷吸光值与活细胞数成正比（下图2）。
∆ 图2
DNA合成增殖试验
BrdU检测法
BrdU为胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于标记活细胞中新合成的DNA（细胞活性周期S期），BrdU可随着DNA复制进入子细胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的细胞DNA都会带有BrdU标记，可通过抗BrdU单克隆抗体检测，借此检测细胞的增殖能力，但BrdU单克隆抗体检测过程需要将部分DNA变性，使部分双股解开成单股才能顺利检测（下图3）。且BrdU为光敏性，因此需要在光线刺激较低（黑暗）的环境下操作，并避光培养。
BrdU为胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于标记活细胞中新合成的DNA（细胞活性周期S期），BrdU可随着DNA复制进入子细胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的细胞DNA都会带有BrdU标记，可通过抗BrdU单克隆抗体检测，借此检测细胞的增殖能力，但BrdU单克隆抗体检测过程需要将部分DNA变性，使部分双股解开成单股才能顺利检测（下图3）。且BrdU为光敏性，因此需要在光线刺激较低（黑暗）的环境下操作，并避光培养。
∆ 图3
EdU检测法
EdU原理跟BrdU检测法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine, T）渗入正在复制的DNA中，并加入能与Edu反应的荧光染料，即可利用检测荧光值侦测应用于细胞增殖，或在细胞组织级别作为标记追踪等研究（下图4），实验过程不需要经过BrdU检测法的DNA变性处理。
ATP是细胞的能量直接来源，ATP发光法是藉由检测细胞内ATP含量来分析细胞增殖。市面上的原理是利用外源的萤火虫荧光素（Luciferin）与荧光素酶（Luciferase），以细胞内含的ATP为能量来源，发生氧化反应产生生物冷光，因此可通过监测冷光光度，来对应ATP含量并判断细胞增殖状况（下图5）。
∆ 图5
荧光染料增殖试验
∆ 图6
台盼蓝细胞计数
∆ 图7
EdU原理跟BrdU检测法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine, T）渗入正在复制的DNA中，并加入能与Edu反应的荧光染料，即可利用检测荧光值侦测应用于细胞增殖，或在细胞组织级别作为标记追踪等研究（下图4），实验过程不需要经过BrdU检测法的DNA变性处理。
∆ 图4
化学发光细胞活性测定
ATP发光法
化学发光细胞活性测定
ATP是细胞的能量直接来源，ATP发光法是藉由检测细胞内ATP含量来分析细胞增殖。市面上的原理是利用外源的萤火虫荧光素（Luciferin）与荧光素酶（Luciferase），以细胞内含的ATP为能量来源，发生氧化反应产生生物冷光，因此可通过监测冷光光度，来对应ATP含量并判断细胞增殖状况（下图5）。
∆ 图5
荧光染料增殖试验
CFSE检测法
CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；当CFSE扩散穿过细胞膜，会与细胞内源酯酶产生水解反应而被激发，发出绿色荧光，这些带荧光的CFSE会进一步与细胞骨架蛋白结合，形成稳定的胞内荧光蛋白。每当细胞进行分裂增殖，胞内荧光蛋白会被平均分配到下一代细胞中，因此细胞荧光强度会随着增殖代数增加而不断地降低（下图6），可用流式细胞仪进一步侦测分析得出细胞分裂增殖的情况。CFSE的浓度，对于最终判断细胞增殖结果有直接性的影响！
CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；当CFSE扩散穿过细胞膜，会与细胞内源酯酶产生水解反应而被激发，发出绿色荧光，这些带荧光的CFSE会进一步与细胞骨架蛋白结合，形成稳定的胞内荧光蛋白。每当细胞进行分裂增殖，胞内荧光蛋白会被平均分配到下一代细胞中，因此细胞荧光强度会随着增殖代数增加而不断地降低（下图6），可用流式细胞仪进一步侦测分析得出细胞分裂增殖的情况。CFSE的浓度，对于最终判断细胞增殖结果有直接性的影响！
∆ 图6
台盼蓝细胞计数
台盼蓝（Trypan Blue）计数法
台盼蓝（BI，货号：03-102-1B）是一种蓝色细胞活性染料，无法通过结构完整的细胞膜进入细胞内部；但细胞死后，丧失细胞膜稳定性，台盼蓝会进入细胞将细胞染成蓝色，因此在细胞实验中，被常规地搭配自动细胞计数仪或血球计数板，应用于区分辨活细胞和死细胞、及检测细胞膜的完整性（如下图7）。
台盼蓝（BI，货号：03-102-1B）是一种蓝色细胞活性染料，无法通过结构完整的细胞膜进入细胞内部；但细胞死后，丧失细胞膜稳定性，台盼蓝会进入细胞将细胞染成蓝色，因此在细胞实验中，被常规地搭配自动细胞计数仪或血球计数板，应用于区分辨活细胞和死细胞、及检测细胞膜的完整性（如下图7）。
∆ 图7
THE END
当然，随着科技的日新月异，会有越来越多更精确的实验方法等着大家去学习研究。
您实验室都在用什么方法测定细胞活性呢? 快在下面留言跟我们分享噢！
Reference
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参考网站：http://tinyurl.com/yyhapr9x
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Riss, Terry L., et al. "Cell viability assays." Assay Guidance Manual [Internet]. Eli Lilly & Company
and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2016.
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