细胞形态异常，鱼骨图来帮忙（二）
2019-09-02 来源:本站 点击次数:3837上次的鱼骨图分析大家还没有看过瘾吧
这不，小编又双叒叕来啦！
说完外源污染，那么接下来我们再从细胞层面讨论讨论
———内源异常
内源异常同样也可以分为以下几点
人为选择/突变
老化
细胞冻存/复苏
融合度过高才传代（>90%）
传代密度过低
接下来，我们将逐条为您剖析噢~
在体外培养细胞的过程中，细胞会因操作过程而产生人为筛选：
- 胰酶消化是最常被忽略的人为选择过程，易被消化的细胞容易被传代；
- 细胞过度的分化或刺激时及可能造成细胞异常的突变，例如 HeLa cell虽然还保有人的基因序列，但染色体数目曾被观察到有异常突变增加（原HeLa为46条，目前有研究人员观察到70-90条染色体的案例）；
- 文献报导指出，hES 细胞株已被证实原位癌基因(TP53) 变异概率，随着培养代数增加更易有突变产生 (Nature 2017)。
解决方案：
建立并记录好细胞档案（形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、有无支原体和潜存病毒等），为保障实验材料的一致性，应将长期使用的细胞株建立细胞种子库（Seed Stock）与工作库（Working Stock）；细胞株建库资料要详细记载，并定期每3-6个月安排身份鉴定 （STR）。美国细胞库（ATCC）建议细胞株入库的基本要求：
（1）培养简历 ：组织来源日期、物种、组织来源、供体正常或异常健康状态、性别、年龄、细胞已传代数等；（2）冻存液 、培养基和保护剂名称；
（3）细胞活力 ，冻融前后细胞接种存活率和生长特性(细胞倍增时间，生长繁殖曲线，分裂指数等)；
（4）培养基种类和名称、血清种类及浓度；
（5）细胞形态类型，如内皮、上皮或成纤维细胞等；
（6）核型二倍体或多倍体，标记染色体有或无；
（7）无污染情况包括细胞、真菌、支原体、原虫和病毒等；
（8）物种检测，以证明细胞有无交叉污染；
（9）免疫检测一两种血清学检测；
（10）细胞建立者姓名、检测者姓名。
老化细胞不会立即死亡，但其基因表达会发生变化，如果细胞老化现象严重，建议从种子库或工作库重新复苏细胞。
解决方案：
Dr. Cell可提供：细胞老化检测（Cell Senescence Detection）细胞老化检测可准确地判断出老化细胞的百分比，以决定是否要使用代数更低的细胞，维持实验材料的一致性。细胞培养过程，防止衰老不二法门：还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种。一旦细胞衰老后，细胞很难再重新年轻化，此时，只能重新复苏细胞。
图1.衰老细胞 图2.正常细胞
慢冻快融
冻存细胞过程，建议程序降温速度为1℃/min。细胞冻存时，细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶的形成后会造成细胞损伤或细胞的死亡。为了保护细胞，冻存时会添加保护剂在冻存液中，目前多采用DMSO或甘油，使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性。
复苏细胞过程，让细胞冻管在37℃环境快速解冻，待其全部快速融化，避免冰晶对细胞造成伤害；解冻后的细胞可直接接种到含完全培养基的细胞培养瓶中进行培养，24小时后再更换新鲜完全培养液，以去除旧培养液中的DMSO; 如果担心DMSO造成细胞毒性，可以待细胞解冻后将细胞缓慢加至含培养基离心管中离心，以稀释DMSO的浓度。复苏的细胞，约需数日或传一至二代，其表现才会恢复稳定。
解决方案：掌握“慢冻快融”的原则，进行程序降温
慢冻→两种办法：
1.手动程序降温，将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。
2.程序降温盒，一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。
快融：将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中（水面需低于管口，避免水分意外进入冻存管造成潜在污染），使细胞冷冻悬液迅速融化；此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围，避免冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成二次伤害。Biological Industries（BI）可提供：
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中文名称 |
货号 |
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无血清细胞冻存液 |
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无血清间充质干细胞冻存液 |
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无血清干细胞冻存液 |
05-710-1 |
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D10无血清冻存液 |
05-713-1 |
一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）。
图3
解决方案：
尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。
哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
图4
解决方案：
细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。
如何确定细胞的正确初始接种密度? 美国细胞库（ATCC）建议各类不同细胞株接种密度：
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细胞类型 |
接种密度 |
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常见肿瘤细胞株 |
2-4 x 106 viable cells/25cm2 |
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成纤维细胞株 |
2-4 x 106 viable cells/25cm2 |
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淋巴细胞/悬浮细胞 |
3-4 x 105 viable cells/ml |
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杂交瘤 |
2 x 105 viable cells/ml |
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成肌细胞 |
1-2 x 104 viable cells/cm2 |
https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx
好啦，本期介绍到这里也就啦
后续小编会根据顺序
继续为大家分享噢~
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