基于报告基因生物学活性探索方法

2020-10-27 来源:本站点击次数:4158

基于报告基因生物学活性探索方法

近年来，随着生物药物的快速发展，报告基因法逐渐应用于生物药的生物学活性检测之中。通常是在充分理解药物分子药理机制的基础上，构建相应的细胞模型，通过激活待测药物参与的信号通路产生生物效应，从而反映药物的生物学活性。

报告基因法是通过分子生物手段将报告基因整合入待测的生物系统中，继而通过检测报告基因产生的信号，研究特定生物学过程的方法。在实际操作中通常是将报告基因与目的基因或调控序列连接，如将报告基因置于特定启动子调控序列之后，研究某种条件下启动子的调控或特定基因调控下目的蛋白的表达。作为报告基因，其序列和功能通常已知且其表达产物易于被检测。目前已鉴定并商品化的报告基因有氯霉素转乙酰酶( CAT)、 β-半乳糖苷酶( β-gal)、β-葡萄糖苷酸酶( p-GUS) 、分泌型碱性磷酸酶( SEAP)、荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白( GFP)等。

药品有效性必须是疗效确切，且含有特定的有效活性成分及一定的浓度含量。在药物研发的过程中，为了评价药物的有效性和临床应用价值，生物学活性的测定是重要的手段之一。现阶段的生物学活性分析方法主要是在体外检测，大多以细胞为基础进行研究。近年来，随着生物药物的快速发展，报告基因法逐渐应用于生物药的生物学活性检测之中。通常是在充分理解药物分子药理机制的基础上，构建相应的细胞模型，通过激活待测药物参与的信号通路产生生物效应，从而反映药物的生物学活性。

下面我们来看下具体的应用实例：

01：抗 HER2 单克隆抗体 ADCC 生物学活性的测定

人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）基因编码了一个跨膜酪氨酸激酶受体家族中的受体蛋白。

该蛋白在正常情况下处于非激活状态，主要在胚胎发育时期表达，成年后仅在少数正常组织中微量表达，参与细胞的分化调控。已有研究表明，HER2 的过表达与肿瘤的发生有密切的关联，在乳腺癌，卵巢癌，胃癌等癌症中均存在不同程度的 HER2 过表达。因此 HER2 是肿瘤免疫治疗研究中的一个重要靶点。

在 HER2 单抗类药物的作用机制里，单抗可作为ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）的潜在介质，与淋巴细胞表面受体结合进而激活效应细胞对肿瘤靶细胞的杀伤。

在经典的 ADCC 测定方法中，是将靶细胞暴露于结合单抗的效应细胞中,如外周血单核细胞（PBMC）或自然杀伤细胞（NK），通过检测细胞毒性判定 ADCC 活性。但该方法依赖原始的效应细胞，原始效应细胞的提取繁琐，个体差异明显，容易造成较高的背景值。将 Jurkat 细胞做工程改造，以 NFAT 应答元件驱动的荧光素酶报告基因检测系统为平台则成功的避免了传统方法的弊端，并可以快速准确的检测单抗的生物学活性。

构建 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 细胞株并进行筛选鉴定，以 SKBR3（乳腺癌细胞系）作为靶细胞。向 SKBR3 细胞板内接种 Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT 细胞，并加入不同浓度梯度的单抗溶液。将细胞板置于 37℃、5% CO₂条件下诱导 20h 后加入荧光素酶底物溶液，避光反应 5min 后使用酶标仪读取荧光信号，所得的数据使用四参数拟合方式，R²>0.99，如图 1，EC50 为 13.27 ng·mL^-1。

图 1 建立抗 HER2 单抗的 ADCC 剂量效应曲线

图 2 利用报告基因法比较 3 株不同的 HER2+ 靶细胞

如图 2，以不同的 HER2⁺ 的人乳腺癌细胞系 SKBR3、BT474 及 MCF7 作为靶细胞进行 ADCC 活性检测，发现 SKBR3 细胞呈现更好的剂量效应。

02：免疫检查点抑制剂——PD1/PD-L1 抗体的生物活性学检测

研究表明 PD-1 主要限制慢性炎症、感染或癌症中的 T 细胞活性，PD-1 有两个配体，PD-L1和PD-L2。在肿瘤的微环境中，肿瘤细胞能够表达 PD-L1或者 PD-L2。癌细胞逃避免疫系统摧毁的一种方法，是通过配体联接到T细胞的 PD-1 蛋白上。当配体与 PD-1 联接以后，T细胞就不能够发现肿瘤和向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。针对 PD-1 分子的负性免疫调节治疗癌症的研究曾于 2018 年荣获诺贝尔生理学或医学奖，目前抗 PD-1 单抗及抗 PD-L1 单抗越来越成为各国抗体研发中炙手可热的治疗性单克隆抗体，作为免疫检测点靶向抗体，可以用于治疗黑色素瘤、晚期肾细胞癌、晚期（转移性）非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、皮肤癌等肿瘤。

PD1 药物的设计思路是：给予肿瘤患者针对 PD-1 或 PD-L1 的一种抗体蛋白质，将使两种蛋白质不会联接，T细胞的功能也不会关停，且 PD-1 通路的抑制会加速和加强自身免疫。

为了验证抗体药物的生物学活性，研究人员构建了分别构建转基因效应细胞系和靶细胞系（如下所示）

效应细胞系：

Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT

( 稳定转染 FcγＲIIIa 及 NFAT 反应元件）

靶细胞系：

293FT-PD-1 ( 稳定转染 PD-1 分子）

CHO-PD-L1 ( 稳定转染 PD-L1 分子）

将 Jurkat-hFcγＲⅢa-NFAT 效应细胞系分别加入到293FT-PD-1和 CHO-PD-L1 细胞中，并对应加入不同浓度的抗 PD-1 单抗和抗 PD-L1 单抗溶液。诱导20h后加入荧光素酶底物，在 Molecular Devices 酶标仪上读取相对光单位( relative light unit，RLU）数值并按以下公式计算诱导倍数( fold of induction， FI) 。FI = RLU( 反应均值－背景均值) /RLU( 阴性对照均值－背景均值） ; 利用 SoftMax 软件分析试验数据，以单抗浓度对数为 x 轴，对应的 FI 值为 y 轴，选用四参数方程回归模型，拟合单抗的剂量效应曲线。

图3 抗PD-1/PD-L1 单抗的 ADCC 剂量效应曲线

研究人员用该检测方法分别确定了效靶比，诱导时间等（图4和图5）。

图4 抗 PD-1/PD-L1 单抗不同效靶比对比结果

图5 抗 PD-1/PD-L1 单抗不同效靶比及诱导时间的信噪比结果

由于很多生物药没有强反应性的细胞系或者没有易检测的细胞学效应，基于报告基因构建转基因细胞系指示药物活性成为很好的选择。中国食品药品检定研究院有丰富的报告基因测定大分子药物生物学活性的技术储备，已经率先建立了多品种的报告基因测活方法，包括干扰素、促胰岛素分泌肽融合蛋白、促红细胞生成素以及抗 VEGF 靶点抗体的荧光素酶报告基因方法。这一系列的研究结果突破了传统生物活性检测的限制，为保证用药的安全性，时效性，提高检验质量提供了保障。

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