1.  摘要
多种基因治疗(GT)产品正在开发当中，以治疗此前无法治疗的遗传性疾病。这些高价值产品的年需求量根据适应症和发病率的不同，差异可能高达7 logs。这种广泛的生产规模范围使GT生产平台化极具挑战性。此外，对于具有非常高年需求量的适应症，传统的贴壁技术，如填充床生物反应器和细胞工厂，不能满足所需的生产能力。这一趋势导致GT制造商转向在搅拌罐生物反应器中使用悬浮细胞进行生产。
 
尽管搅拌罐生物反应器在抗体和重组蛋白生产方面有良好的过往记录，并且有多种尺寸可供使用，但这些系统的使用也有诸多限制，包括比蛋白质工艺更低的细胞密度，比贴壁细胞培养更低的特异性产率，以及细胞培养中产生的大体积料液带来的中游和下游瓶颈。
 
针对工艺强化和链接 (整合式连续工艺) 而设计的新技术可使产量比基于传统可放大的贴壁技术提高4倍。最近，这些技术已经被应用于悬浮细胞培养，达到了与悬浮对照工艺相同的产量。这也意味着，强化和链接性的生物反应器可相当于2,000L或以上的搅拌罐反应器体系（STR）。本文将讨论这些技术如何弥合产能差距、基因治疗平台化生产、以及减少操作占地。
 
2. 简介
2.1  当前的市场考量
在未来的2025年，GT市场预计价值将达到120亿美元。这些产品主要针对一些目前没有治疗方法的适应症，以显著提高患者的生活质量，甚至于可提高患者的生存机会。相较而言，单抗的年需求量(在美国)估计在数百克(如Remicade®)到数百公斤(如Rituxan®)之间，基因治疗产品的需求量差异可能>7 logs。
   
例如，用于利伯氏先天性黑蒙的基于AAV的治疗剂量可能为1 x 10¹¹病毒基因组(vgs)，而治疗脊肌萎缩症 (SMA) 的剂量可能为1x10¹⁴ vgs。
 
此外，杜氏肌萎缩症(DMD)的治疗预计将导致1 × 10²⁰ vgs的年需求量，这是由每个患者的高剂量和年需求量结合得出的。
 
由于GT开发商通常会试图以不同的适应症为目标，年度需求的显著差异会导致GT制造商针对不同类型的应用采取不同的技术，而不是采用单一的技术，并像单抗行业那样，根据适应症的需求而调整规模。技术创新是否能够在不进行重大平台调整的情况下实现显著的灵活性，以适应不同的目标适应症?
 
2.2  GT制造的技术蓝图，离我们还有多远？
传统的病毒载体生产依赖于规模扩展的方法，以达到目标规模。这种方法使用的技术包括细胞工厂和培养瓶。与其它类型的生物制品一样，规模扩展以获得大量的病毒载体的方法也存在一些缺点，如产量限制、占地、人工操作数量等，导致出现占地面积、资本支出、运营成本和再现性方面的问题。
 
固定床生物反应器，历史上曾被用于疫苗应用，已经调整用于基因治疗领域，其提供了一个可规模放大的解决方案，以使用贴壁细胞生产病毒载体。然而，这种生物反应器不能提供足够的产能。这种产能的限制促使基因治疗的开发商将注意力转向在搅拌罐生物反应器(STR)中进行的悬浮细胞培养。
 
   
STR似乎是GT制造中最灵活且可放大的传统技术。然而，对于年需求量较高的适应症，例如A型血友病或杜氏肌萎缩症，即使是2,000L的STR也不够。对于这样的情况，产能差距只能通过使用多个系统并行地规模扩展生产来解决。Camau等人(n.d.)通过计算不同技术中剂量为1x10¹⁴vgs的产品每剂的产品成本(CoG)，说明了可放大性的好处。结果表明，多层培养瓶的每剂产品成本为~15,000USD，1,000L STR和333m²填料床生物反应器的每剂产品成本分别为~12,000 USD和~8,000USD。本研究表明，为了达到同样的产量，STR需要更高的DNA/细胞比例 (1.5 ug/M细胞 vs 1ug/M细胞)，从而相对于填充床反应器，导致更高的CoG/剂。本文中显示的CoG/剂比高剂量单抗产品的每剂产品成本高10至500倍。技术创新能否在缩小规模差距的同时降低病毒载体制造的制造成本?
 
3. 搅拌罐生物反应器在基因治疗制造中的前景
STR有多个优点，首先这些系统的采购来源较多，并且已被很好地理解，因为它们已经被成功地应用于蛋白质和疫苗生产。此外，许多进入基因治疗领域的工艺开发专业人员都有已建立的、基于悬液培养的抗体和蛋白质生产背景。悬浮培养中病毒载体生产始于细胞的扩增，以创造足够的生物量，用于接种最终的生物反应器规模。一旦细胞在最终的生物反应器中生长至~1 × 10⁶ cells/ml (这与典型的抗体工艺相比，是相当低的数值)，进行细胞转染步骤。细胞培养、转染和病毒生产阶段通常以批次和补料分批模式进行，也无法除培养基或进行洗脱步骤。当使用灌流时，需要细胞截留装置，其可能对细胞健康有些害。对于细胞内产物，在工艺结束时，得在生物反应器中进行直接裂解步骤。之后，在生物反应器中进行Benzonase处理，以消解DNA。经Benzonase处理的原液随后被澄清，以进行下游工艺(DSP)的后续阶段。

  当使用1,000L 收获体积的STR时，必须在上游和中游工艺之间的连接点处理大量含有培养基的产物，这将影响工厂设计、占地面积以及操作的方便性。对于需要多个STR并行操作的适应症，如杜氏肌萎缩症，这种影响将被进一步放大。
 
单抗开发商已经采用了整合式连续工艺技术，将灌流操作链接至多柱层析系统，以提高产量，同时降低占地面积。考虑到HEK293细胞的剪切敏感性，使其难以接入ATF和TFF等细胞截留系统，所以，将前述工艺设计直接转移到使用STR的GT制造中会带来一些挑战。这也意味着在使用STR的整个制造过程中，进行培养基置换是非常有挑战性的步骤。
 
STR的高占地面积，加上对中间储罐的需求以及独立单元操作的使用，导致了非常高的操作占地面积。图4所示为容纳1,000LSTR工艺所需的占地面积。支持这一工艺所需的总占地面积是97m2。对于需要多个生产链并行运行的高年度需求生产，中游工艺设备可能可以跨批共享，然而，这不会显著减少占地。技术创新能否消除GT制造中游和下游工艺操作的瓶颈?

   
4. 工艺强化和链接：GT制造的模式转变 
Univercells Technologies开发了一系列下一代技术，旨在解决基因治疗和疫苗生产商在需求、产品成本和工厂占地方面面临的挑战。这些技术应用了工艺强化和链接的原理，以重新定义GT制造中的可放大性。强化指的是在更小的操作占地中实现高产量，而链接指的是将不同的单元操作连接在一起，以实现整合的连续生物工艺。
 
工艺强化主要是通过在结构化卷式生物反应器 scale-X™中的生物质浓缩和固定来实现。通过将中游单元操作连接到NevoLine™平台的scale-X生物反应器，强化得到了进一步的提升。NevoLine平台能够在最重要的步骤中降低体积 (图3)。

4.1   scale-X生物反应器 – 基于悬浮和贴壁GT制造的两用平台
scale- x™生物反应器组合包括使用卷式固定床的自动化、强化生物反应器 (图5)，其提供不同规模的配置，以促进工艺从研发到商业规模GMP生产的过渡。scale-X生物反应器由独特的双层结构组成，其中，亲水性PET层用于细胞生长，疏水性聚丙烯网层用于培养基流动。
    
上述特点与结构化设计相结合，可实现细胞均匀分布以及营养物的高度利用，同时限制对细胞的剪切。这种设计还提高了可放大性，并增强了工艺的稳健性，因为在不同规模和生产批次之间可维持固定床压实性。
 
Scale-X生物反应器产品系列可分为三组：hydro (研发规模)，carbo (中等规模、规模放大研究、小批量临床和商业化生产)以及nitro (大规模临床和商业规模生产)。在scale-X生物反应器中，细胞贴附或捕获在纤维内，而培养基流动进、出生物反应器。
   
Scale-X生物反应器的设计已被证实可获得相比其它基于贴壁细胞病毒生产的替代性系统显著更高的产量，使其成为最先进的、基于贴壁细胞的病毒载体和病毒疫苗生产技术。
 
4.1.1.  Scale-X生物反应器中的贴壁细胞培养
Duyck 等 (2019)在一个简单的概念验证（PoC）研究中，描述了结构化固定床设计的使用，其在有限优化的前提下，使用贴壁HEK293细胞，生产基于AAV的产品，相比在细胞工厂中进行的标准工艺，接种和转染密度降低了3倍。在此研究中，细胞生长培养基用量降低了~90%，并对洗脱步骤数进行了优化。
   
此案例研究的结果表明，在基于贴壁的GT生产中，scale-X技术有多个关键优势： 

1. 使用最小的优化，即可将工艺从平面器皿转移到可放大技术，并获得相同的性能：这可以显著降低工艺开发和规模放大时间线和成本。这也意味着GT开发商现在可以使用平面器皿来满足极低年需求量的产品，如利伯氏先天性黑蒙，并很容易将这些平台工艺转移到可规模放大的技术，如scale-X生物反应器。
2. 可以降低接种密度：降低接种密度可以减小到达最终生物反应器的种子扩增链的规模，减少占地、人员需求和产品的总成本。
3. 可以降低CDAT：DNA和PEI是病毒载体制造中的一些关键成本驱动因素。由于这些试剂的添加与转染时的细胞密度有关，降低转染时的细胞密度将对产品成本产生重大影响。
4. 与传统用于基于贴壁细胞的病毒载体生产的可放大技术相比，可以达到显著更高的产量。与传统填充床生物反应器相比，scale-X生物反应器的产量提高了4倍。考虑到GT行业的产能挑战 (图2)，这些结果清楚地说明了下一代技术在弥补GT生物工艺产能差距方面的作用。此外，考虑到GT制造中的物料成本，用相同数量的原材料生产更多产品的能力将在降低产品成本、以克服获得GT产品的经济阻碍方面发挥关键作用。

 
4.1.2 Scale-X生物反应器中的悬浮细胞培养 
最近的一项PoC研究探索了scale-X生物反应器在悬浮细胞培养中的优势，其使用HEK293细胞，在无血清培养基中，生产基于腺病毒的疫苗。实验进行了3次生物反应器运行，以评估（1）固定床的细胞截留效率，（2）固定床与悬浮培养对照组中的细胞生长趋势，以及(3)达到参考工艺70,000 vp/cell产率的能力。比较使用接种密度为5x10⁵ cells/mL的250 mL摇瓶。
 
在生物反应器运行#1的实验中，进行了简单的工艺转移。在生物反应器运行#2的实验中，生产阶段的持续时间在3天后增加，以便观察在3天的病毒生产后产量是否达到稳定状态，就像参考工艺中的情况那样。在生物反应器运行#3的实验中，提高了感染时的细胞密度，以评估生物量对产量的影响。
   
本案例研究的结果证实了对于基于悬浮的GT生产，scale-X技术的多个关键好处：

1. 可以在结构化固定床生物反应器中截留并生长悬浮细胞。悬浮细胞被成功截留在结构化固定床生物反应器中，细胞生长阶段上清液的生物量低于5%，病毒产生阶段低于细胞的20%。
2. 可以快速将基于悬浮的工艺转移至结构化固定床生物反应器：结果清楚地显示，即使没有对工艺进行更改(运行#1的实验中)，也超过了70,000 vp/cell的特异性细胞产率。
3. 可以提高结构化固定床生物反应器中进行的工艺的稳健性。在41至44小时之间，不同运行的PDT相当。
4. 对于悬浮系统，结构化固定床生物反应器有可能潜在地提高特异性细胞产率：相比摇瓶对照组，所有scale-X运行都实现了更高的特异性细胞产率。在运行#3实验的最佳情况下，scale-X中的特异性产率是摇瓶的1.7倍，这个值为结构化固定床生物反应器中基于悬浮培养的工艺优化所能实现的目标奠定了基础。
5. 改用scale-X生物反应器可以降低培养基消耗。在实验中，scale-X生物反应器的单位细胞培养基用量比摇瓶低12.5%。
6. Scale-X生物反应器是唯一的双用途平台技术，可使用悬浮和贴壁细胞进行病毒生产。目前的GT制造技术分为贴壁技术(平面器皿、固定床生物反应器)和悬浮技术(STR)。本案例研究，结合Duyck等人(2019年)的研究，第一次表明，有可能将技术与工艺脱钩，而采用能同时实现基于贴壁和悬浮细胞的病毒生产的系统，且其可简化跨技术的工艺转移。

 
4.2 NevoLine平台 – 优化上游到下游的生产线
在scale-X生物反应器中，由于细胞浓缩在固定床中，当培养基进出生物反应器时，它们仍停留在生物反应器中，避免了使用传统细胞截留系统时，与剪切敏感性相关的挑战。NevoLine系统可以实现灌流液澄清和浓缩(在连续或批次模式下)，从而将浓缩且澄清的原液转移至DSP车间。
    
在NevoLine中，生产过程从在平面器皿或摇瓶中的n-2种子阶段开始，然后是在平面器皿或波浪型生物反应器中进行的n-1阶段。scale-X nitro生物反应器可以在低细胞密度下接种，然后在固定床中进行生物量倍增。scale-X生物反应器的最大罐体积为60L，可用于600m²的nitro。培养基循环或灌流通过固定床。在灌流模式中，在线收集并浓缩灌流液。对于裂解工艺，细胞裂解通过在生物反应器或收获罐中使用Benzonase处理，以裂解截留在固定床中的细胞。
 
NevoLine获得的最终产物是澄清且浓缩的物料，可直接进入DSP。工艺序列和部件可以根据客户的特定工艺而调整。图10所示为NevoLine中的整合式连续工艺，可以将进入DSP的体积降低到100L以下。
    
5.  GT制造技术创新的有形和无形效益
本文介绍了技术创新投资的有形和无形效益。新技术对GT制造现状的积极影响总结如下：
 

机会	描述	影响
工艺强化	卷式固定床双层设计可促进细胞在PET织物微环境中的截留，同时允许培养基和试剂流过网状层而不干扰细胞；这是一个非常重要的优势，因为它可实现灌流操作，且降低了处理体积，而不需要ATF/TFF系统，后者是额外的单元操作，是产物和细胞活性损失的潜在原因。此外，将单元操作链接在一起，进一步降低了处理体积。	低操作占地，降低资本支出
工艺的灵活性	将细胞（贴壁或悬浮）截留在固定床中的能力允许漂洗生物反应器，例如去除对细胞有毒性的残余PEI，因此，生物反应器漂洗可以对整体产量产生积极的影响。 此外，NevoLine平台的设计考虑了灵活性，以便通过链接流路配置及配方设置，实现不同的工艺设计。	简化多产品生产
整合的连续工艺	NevoLine是一种自动化系统，可实现整合式连续工艺，无需操作员干预。	更高的产量 & 工艺稳健性
精简的种子扩增	对贴壁细胞培养的一种批评是基于平面器皿的种子扩增操作的耗时和繁琐性。 这可以用波浪生物反应器来克服。悬浮细胞种子扩增更简单，而可采用固定床生物反应器。在scale-X生物反应器中，可以降低传代数，因为生物反应器可以使用较低的细胞密度接种，最终的生物量扩增在生物反应器内发生。	占地 & 人工干预减少，降低了资本支出，同时劳动力成本降低，工艺稳健性提供
易于实现工艺平台化的开发	本文证实，scale-X生物反应器可以简化基于贴壁细胞和悬浮细胞的工艺转移，以最少的运行次数，达到目标产量。	降低开发时间成本
可放大性	Scale-X生物反应器提供从2.4m2到600 m2的多种配置，以支持客户开发旅程的不同阶段。这些系统在设计上具有良好的可放大性，因为结构化的固定床确保了不同规模固定床的均匀压实。	降低开发时间成本 更高的工艺稳健性
增强工艺性能	本文报道的结果表明，在没有进行大量优化工作的情况下，对于贴壁和悬浮细胞培养，scale-X生物反应器的特异性细胞产率始终高于竞争技术。这为通过工艺优化，提升系统性能，设定了基础。	更高的产能和更低的产品成本
工艺效率	USP：对于某些试剂，添加到工艺中的体积高度取决于需要处理的总体积，如用于细胞裂解的去垢剂(如Triton)以及用于DNA消解的Benzonase。当使用scale-X生物反应器时，强化的设计减少了需使用这些试剂进行处理的体积，从而减少了其用量。这点对于Benzonase这种昂贵的试剂来说尤为重要。 DSP：固定床生物反应器本身可作为一个过滤器，因此，根据工艺的不同，其可截留大部分的细胞或细胞碎片，从而使进入纯化阶段的料液整体上更干净，降低过滤器的尺寸。此外，对于细胞内产物，培养基来源(外部培养基罐)和细胞的位置(scale-X生物反应器)是分离的，这意味着需要处理的整体体积可以大大减少 - 从1,000L到~100L (包括漂洗)。对于细胞外产物，当scale-X与TFF系统链接时，可以实现类似的效果，其可使产物在生产时被浓缩，从而降低DSP中需处理的体积，继而降低工艺时间。	降低工艺时间、操作占地和产品成本

 
6.  技术创新赋能生物制造的下一个变革 
本文强调了GT制造面临的一些挑战，包括产能限制、灵活性、工艺平台化以及产品成本。本文还显示，使用目前市面上的技术，工艺由技术定义，例如，填充床生物反应器和细胞工厂用于贴壁细胞培养，而STR用于悬浮细胞培养。此外，跨技术的工艺转移会导致产量的显著下降。
 
本文的其它见解包括规模和处理体积之间的权衡，因为填充床生物反应器的处理体积和生产能力较低。而另一方面，STR可提供高达2000L的产能，但产生的大体积可能会导致中游工艺的瓶颈。此外，对于年需求量非常大的产品，即使是2000 L的STR也不能满足产能需求。
   
技术创新为上述挑战提供了解决方案。本文证明了新型结构化固定床生物反应器可以使工艺与技术脱钩，即其可用于悬浮和贴壁细胞工艺。对于GT开发商来说，这提供了一个独特的机会，可以将工艺平台化，轻松地使其适应可放大的技术，从而加快开发进度，并降低成本。对于CDMO来说，这也提供了一个独特的机会，可通过采用两用技术，提高洁净室的利用率。此外，与其它可放大技术相比，结构化固定床设计可以提高悬浮工艺和贴壁工艺的特异性细胞产率。
 
当这些结构化固定床生物反应器与整合式连续生产的自动化技术相结合时，处理体积可从1000L降低到<100 L，消除了中游工艺的瓶颈。