一次性使用生物反应器在病毒载体生产中的应用
2021-05-11 来源:本站 点击次数:5442
用于病毒载体生产的可放大、高性能一次性使用生物反应器技术
案例研究：基于腺相关病毒的基因治疗
M. Duyck, Y. Dohogne, R. Lievrouw, N. Jafar, F. Kasper, J. Wielgomas, A. Aare, K. Barglow, J. Castillo
摘要
最近基因疗法的成功导致了对病毒载体的需求激增，超过了目前的生产能力。然而，使用传统技术(如搅拌槽、静态细胞培养)生产病毒载体的方法存在一些局限性，包括可放大性有限、灵活性差、生产成本高。
为了应对这些挑战，Univercells开发了一次性使用固定床scale-X™生物反应器，用于增强病毒产品的上游工艺。scale-X产品组合通过工程设计，提供了系统的线性放大性，可适应从工艺开发到大规模商业化生产的病毒式生产。
4DMT, Inc.是一家处于开发阶段的精准基因治疗公司，致力于基于下一代AAV载体的开创性靶向治疗的开发。4DMT的专利治疗性载体进化平台使“疾病优先”的产品发现和开发方法成为可能，从而允许定制AAV载体，以靶向与潜在疾病相关的特定组织类型。这些专利AAV载体旨在通过常规临床途径实现靶向递送、高效转导、降低免疫原性以及针对已有抗体的耐受性。
在这项研究中，使用HEK293细胞和4DMT载体的rAAV工艺从静态细胞培养系统转移到了Univercells 的scale-X生物反应器。我们发现细胞分布均匀，病毒滴度增加，从而显著减少了生产时间和成本。
1. scale-XTM一次性使用固定床生物反应器
Scale-X生物反应器系统是基于可增强均质性的紧凑且结构化固定床的一次性使用生物反应器（图1）。该系统提供自动参数控制，并允许轻松进行培养基和细胞取样。
生物反应器与在线TFF产物浓缩在收获瓶中链接，从而消除了初步澄清步骤。
图1. Scale-X carbo生物反应器示意图。
产品范围包括工艺开发（scale-X hydro，2.4 m2）、中试规模培养（scale-X carbo，10和30 m2）以及中到大规模工业生产（scale-X nitro， 200-600 m2）。Scale-X nitro生物反应器是目前市面上最大的固定床系统，已集成到NevoLine™生物制造平台中，可满足基因治疗病毒载体的需求（图2）。
图2. Scale-X生物反应器产品范围以及集成至NevoLine生产平台。
2. 材料和方法
Scale-X
>> Scale-X hydro生物反应器（2.4m2 生长面积）
>> 培养：来自冻存细胞库的HEK293细胞，接种至塑料平面培养瓶，于37℃、5% CO2孵育
>> 链接的TFF：WaterSep中空纤维过滤器，MWCO 100kD，表面积1300 cm2，目标体积浓缩因子（VCF）：10-15
对照
>> Corning Cell Stack 1层（CS1）作为对照组#1-4；
>> 在37°C、5% CO2的加湿培养箱中操作，使用相同的接种密度以及培养基比例体积
方法
>> 细胞密度确定使用重复组的胰蛋白酶消化(对照组)
>> 在scale-X生物反应器中，细胞密度确定使用结晶紫染色并计数玻片上的细胞核
>> 使用PEI进行三重转染
>> 使用ddPCR检测病毒滴度
细胞培养和转染工艺
图3所示为在scale-X hydro生物反应器中进行的细胞培养和转染工艺。工艺转移后，对初步工艺优化进行评估：
>> 实验#1：直接从培养瓶转移到scale-X生物反应器。
>> 实验#2：评估pH值变化对产量的影响。
>> 实验#3：降低接种细胞密度，优化转染试剂的用量。
>> 实验#4：通过减少生长培养基以及在收获期间引入第三次漂洗，以进一步优化工艺。批次中引入TFF病毒浓缩，而去除初步澄清。
图3. 在scale-X生物反应器（2.4 m2）中实验设置的工艺流程示意图
3.在scale-X hydro生物反应器中均匀的细胞分布
>> HEK293细胞在固定床中呈均匀的轴向和径向分布(图4)，使可用于细胞生长的表面积得到最佳利用。
>> Scale-x固定床的取样代表了整个固定床内细胞的平均密度。
图4. Scale-X hydro生物反应器中的轴向和径向HEK293 细胞分布
4. 细胞生长、病毒表达和链接的浓缩
概念验证和优化目标
1. 参考工艺适应scale-X技术
2. 确定和优化关键工艺参数，以实现高rAAV产量
3. 使用链接/在线TFF进行病毒浓缩
细胞生长
>>在4个实验中，生物反应器中HEK293细胞的生长性能与平面对照组相似(图5)，达到了较高的细胞密度(>在收获当天增加了14倍)。
>>没有观察到针对工艺优化而进行的变化到对培养的负面影响：pH值 (#1：7.2，#2-4：7.0)以及生长阶段体积/表面比降低(# 4降低了2倍)。
图5. 生长于scale-X hydro生物反应器和塑料平面培养瓶对照组中HEK293 细胞生长曲线的比较
鉴别和优化关键工艺参数，以获得高rAAV产量
>>工艺转移实验(#1)获得产量达平均参考的45%，在预期的范围内。
>>实验#2的收率结果显示，低pH没有影响，可允许在整个工艺过程中使用更低量的碱。
>>实验3的结果与运行#1和2的结果相似，尽管在转染时，基于较低的细胞密度，转染的DNA和PEI浓度降低了3倍。
>>实验条件#4的产量与参考工艺相似(98%)，即使在生长阶段培养基体积减少。
>>4DMT在其它替代性填充床生物反应器技术中进行了一组实验。测试了各种培养条件，总体上表明与参考工艺相比，平均产量仅为25%。
→实验表明，从平面培养设备到我们的可放大技术的工艺转移容易实现。
→只需进行较少的工艺优化，即可在scale-X生物反应器获得相似的滴度。
图6. scale-X hydro生物反应器、CS10中的平均参考值以及替代性填充床生物反应器中的rAAV滴度比较
不同条件的替代性填充床生物反应器（1.6 m2，n=1；4 m2，n=6）
工艺规模放大和链接的TFF浓缩
实验结果可扩展至大规模生产，包括参考工艺和优化工艺(图7)。Scale-X hydro生物反应器(2.4m2)的实验体积可扩展至scale-X carbo和nitro系统(在初始实验的基础上总体积减少25%)。
>>Scale-X狭窄的固定床可捕获主要杂质，并作为预澄清，从而去除初始的澄清步骤，并允许使用TFF直接浓缩产物。
>>采用在线浓缩，可大幅降低收获体积，在大规模条件下，从参考工艺的1,215 L降低到80 L。
→这种幅度的体积降低对工艺成本和时间可产生积极的影响。
总结和未来步骤
>>成功地将细胞培养工艺从静态塑料器皿转移到固定床生物反应器，从而实现了低占地和高经济效益的生产
>>通过少量实验即可实现初步工艺强化：
•降低细胞接种密度→缩短种子扩增过程
•减少三倍的DNA和PEI用量→降低物料成本
•生长阶段更低的培养基体积→降低物料成本
•scale-X生物反应器与链接的TFF相结合，可降低收获液体积，省去澄清步骤
→降低时间和物料成本
>>初步的工艺优化和细胞均质性评估证实了scale-X生物反应器的高性能和可再现性，相比其它替代性填充床生物反应器可获得更高的产量
>>下一步的计划将规模放大至结合了在线TFF的scale-X carbo和nitro生物反应器的生产水平，以进一步强化工艺。
>>与其它贴壁细胞培养技术不同的是，scale-X生物反应器可实现工艺强化，从而显著降低成本和时间。
scale-X carbo 生物反应器 - 重塑台式规模病毒生产
NevoLine™上游平台，用于病毒生产、浓缩和澄清
Changing the Biomanufacturing Paradigm - 改变生物药品制造 · 创新模块化的生产
案例研究：基于腺相关病毒的基因治疗
M. Duyck, Y. Dohogne, R. Lievrouw, N. Jafar, F. Kasper, J. Wielgomas, A. Aare, K. Barglow, J. Castillo
摘要
最近基因疗法的成功导致了对病毒载体的需求激增，超过了目前的生产能力。然而，使用传统技术(如搅拌槽、静态细胞培养)生产病毒载体的方法存在一些局限性，包括可放大性有限、灵活性差、生产成本高。
为了应对这些挑战，Univercells开发了一次性使用固定床scale-X™生物反应器，用于增强病毒产品的上游工艺。scale-X产品组合通过工程设计，提供了系统的线性放大性，可适应从工艺开发到大规模商业化生产的病毒式生产。
4DMT, Inc.是一家处于开发阶段的精准基因治疗公司，致力于基于下一代AAV载体的开创性靶向治疗的开发。4DMT的专利治疗性载体进化平台使“疾病优先”的产品发现和开发方法成为可能，从而允许定制AAV载体，以靶向与潜在疾病相关的特定组织类型。这些专利AAV载体旨在通过常规临床途径实现靶向递送、高效转导、降低免疫原性以及针对已有抗体的耐受性。
在这项研究中，使用HEK293细胞和4DMT载体的rAAV工艺从静态细胞培养系统转移到了Univercells 的scale-X生物反应器。我们发现细胞分布均匀，病毒滴度增加，从而显著减少了生产时间和成本。
1. scale-XTM一次性使用固定床生物反应器
Scale-X生物反应器系统是基于可增强均质性的紧凑且结构化固定床的一次性使用生物反应器（图1）。该系统提供自动参数控制，并允许轻松进行培养基和细胞取样。
生物反应器与在线TFF产物浓缩在收获瓶中链接，从而消除了初步澄清步骤。
图1. Scale-X carbo生物反应器示意图。
产品范围包括工艺开发（scale-X hydro，2.4 m2）、中试规模培养（scale-X carbo，10和30 m2）以及中到大规模工业生产（scale-X nitro， 200-600 m2）。Scale-X nitro生物反应器是目前市面上最大的固定床系统，已集成到NevoLine™生物制造平台中，可满足基因治疗病毒载体的需求（图2）。
图2. Scale-X生物反应器产品范围以及集成至NevoLine生产平台。
2. 材料和方法
Scale-X
>> Scale-X hydro生物反应器（2.4m2 生长面积）
>> 培养：来自冻存细胞库的HEK293细胞，接种至塑料平面培养瓶，于37℃、5% CO2孵育
>> 链接的TFF：WaterSep中空纤维过滤器，MWCO 100kD，表面积1300 cm2，目标体积浓缩因子（VCF）：10-15
对照
>> Corning Cell Stack 1层（CS1）作为对照组#1-4；
>> 在37°C、5% CO2的加湿培养箱中操作，使用相同的接种密度以及培养基比例体积
方法
>> 细胞密度确定使用重复组的胰蛋白酶消化(对照组)
>> 在scale-X生物反应器中，细胞密度确定使用结晶紫染色并计数玻片上的细胞核
>> 使用PEI进行三重转染
>> 使用ddPCR检测病毒滴度
细胞培养和转染工艺
图3所示为在scale-X hydro生物反应器中进行的细胞培养和转染工艺。工艺转移后，对初步工艺优化进行评估：
>> 实验#1：直接从培养瓶转移到scale-X生物反应器。
>> 实验#2：评估pH值变化对产量的影响。
>> 实验#3：降低接种细胞密度，优化转染试剂的用量。
>> 实验#4：通过减少生长培养基以及在收获期间引入第三次漂洗，以进一步优化工艺。批次中引入TFF病毒浓缩，而去除初步澄清。
图3. 在scale-X生物反应器（2.4 m2）中实验设置的工艺流程示意图
3.在scale-X hydro生物反应器中均匀的细胞分布
>> HEK293细胞在固定床中呈均匀的轴向和径向分布(图4)，使可用于细胞生长的表面积得到最佳利用。
>> Scale-x固定床的取样代表了整个固定床内细胞的平均密度。
4. 细胞生长、病毒表达和链接的浓缩
概念验证和优化目标
1. 参考工艺适应scale-X技术
2. 确定和优化关键工艺参数，以实现高rAAV产量
3. 使用链接/在线TFF进行病毒浓缩
细胞生长
>>在4个实验中，生物反应器中HEK293细胞的生长性能与平面对照组相似(图5)，达到了较高的细胞密度(>在收获当天增加了14倍)。
>>没有观察到针对工艺优化而进行的变化到对培养的负面影响：pH值 (#1：7.2，#2-4：7.0)以及生长阶段体积/表面比降低(# 4降低了2倍)。
鉴别和优化关键工艺参数，以获得高rAAV产量
>>工艺转移实验(#1)获得产量达平均参考的45%，在预期的范围内。
>>实验#2的收率结果显示，低pH没有影响，可允许在整个工艺过程中使用更低量的碱。
>>实验3的结果与运行#1和2的结果相似，尽管在转染时，基于较低的细胞密度，转染的DNA和PEI浓度降低了3倍。
>>实验条件#4的产量与参考工艺相似(98%)，即使在生长阶段培养基体积减少。
>>4DMT在其它替代性填充床生物反应器技术中进行了一组实验。测试了各种培养条件，总体上表明与参考工艺相比，平均产量仅为25%。
→实验表明，从平面培养设备到我们的可放大技术的工艺转移容易实现。
→只需进行较少的工艺优化，即可在scale-X生物反应器获得相似的滴度。
不同条件的替代性填充床生物反应器（1.6 m2，n=1；4 m2，n=6）
工艺规模放大和链接的TFF浓缩
实验结果可扩展至大规模生产，包括参考工艺和优化工艺(图7)。Scale-X hydro生物反应器(2.4m2)的实验体积可扩展至scale-X carbo和nitro系统(在初始实验的基础上总体积减少25%)。
>>Scale-X狭窄的固定床可捕获主要杂质，并作为预澄清，从而去除初始的澄清步骤，并允许使用TFF直接浓缩产物。
>>采用在线浓缩，可大幅降低收获体积，在大规模条件下，从参考工艺的1,215 L降低到80 L。
→这种幅度的体积降低对工艺成本和时间可产生积极的影响。
总结和未来步骤
>>成功地将细胞培养工艺从静态塑料器皿转移到固定床生物反应器，从而实现了低占地和高经济效益的生产
>>通过少量实验即可实现初步工艺强化：
•降低细胞接种密度→缩短种子扩增过程
•减少三倍的DNA和PEI用量→降低物料成本
•生长阶段更低的培养基体积→降低物料成本
•scale-X生物反应器与链接的TFF相结合，可降低收获液体积，省去澄清步骤
→降低时间和物料成本
>>初步的工艺优化和细胞均质性评估证实了scale-X生物反应器的高性能和可再现性，相比其它替代性填充床生物反应器可获得更高的产量
>>下一步的计划将规模放大至结合了在线TFF的scale-X carbo和nitro生物反应器的生产水平，以进一步强化工艺。
>>与其它贴壁细胞培养技术不同的是，scale-X生物反应器可实现工艺强化，从而显著降低成本和时间。
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