本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

冰冻切片H&E染色

1、将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2、将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3、将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

◆ 将脑片浸没在氯仿和100%乙醇混合物中至少1小时。

◆ 将脑片分别在100%、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：

必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4、染色步骤：

◆ 将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

◆ 用蒸馏水洗2次。

◆ 用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

◆ 用蒸馏水洗2次。

◆ 用伊红染色10秒

◆ 用蒸馏水洗2次。

◆ 用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脱水1次，每次3分钟。

◆ 用100%乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

◆ 用二甲苯处理5分钟

◆ 滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

石蜡切片H&E染色

1、修剪组织：如果大脑固定在4%的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2、处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3、组织包埋的步骤:

◆ 加热温度控制在59~61℃；

◆ 样品控制台温度在59~61℃；

◆ 冷冻台温度为5℃；

◆ 组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：

不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把包埋底模放在冷冻台上，冷却20分钟。

4、室温下在切片机上切片：

◆ 水浴温度控制在45~50℃。

◆ 石蜡组织放在冰水混合物中。

◆ 室温下设置好切片机。

◆ 45℃，吹干载玻片20分钟。

◆ 蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

◆ 切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

◆ 脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5、预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6、HE染色：可以自动也可以手动进行。

自动

染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

◆ 3次二甲苯；

◆ 2次100%乙醇；

◆ 2次95%乙醇；

◆ 苏木素染色；

◆ 2次95%乙醇；

◆ 70%乙醇；

◆ 伊红染色；

◆ 70%乙醇；

◆ 3次二甲苯。

手动

每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

◆ 注意事项：

（1）封片前片子不要干燥，封片剂将永 久地封住脑片；

（2）在完全干燥之前保证片子平整；

（3）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

◆ 手动的HE染色方法：

（1）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

（2）100%乙醇，每片10滴；

（3）95%乙醇，2次，每片10滴；

（4）蒸馏水洗；

（5）苏木素染色15分钟；

（6）蒸馏水洗2次；

（7）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

（8）蒸馏水洗2次；

（9）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

（10）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

（11）100%乙醇，每片10滴；

（12）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：