血管平滑肌细胞 (VSMCs) 是动脉的主要细胞成分，是血管疾病的关键决定因素。 VSMC 的凋亡已被证明是高血压环境中动脉重塑的重要过程。在全身性高血压动脉重塑过程中，促进VSMC凋亡，细胞外胶原合成和降解失衡，导致血管壁胶原过度沉积。

在高血压期间，机械循环牵张力（定义为血管壁随着心动周期有节奏地扩张和松弛时细胞的重复变形）显著增加。机械循环拉伸可诱导VSMCs 的表型转换、增殖、凋亡和迁移。许多机械响应信号通路已被证明受循环拉伸的影响，包括 PI3K/Akt、NFκB、和 MAPK 通路等。

此外，细胞质和细胞核中的细胞骨架蛋白也对不同程度的循环拉伸有反应。例如，循环拉伸诱导微丝的调整和重组。研究表明，核纤层蛋白 A 和 emerin 是细胞核中重要的细胞骨架蛋白，它们对循环拉伸和剪切应力都有反应。

核纤层蛋白（Lamins） 是核中间丝蛋白，构成核纤层的结构成分，核纤层是内核膜下方的蛋白质网络，决定核的形状和大小。在哺乳动物细胞中发现了两种类型的核纤层蛋白：A 型核纤层蛋白，包括核纤层蛋白 A、C、A∆10 和 C2，由单个基因 (Lmna) 编码，在分化细胞中发育调节和表达；B 型核纤层蛋白，包括核纤层蛋白 B1 和 B2/B3，由两个不同的基因编码，并在所有细胞中表达。在机械反应过程中，核纤层蛋白 A 和 C （lamin A/C ）是已被广泛研究的应力敏感分子。尽管研究已经证明不同类型的机械刺激可以调节 lamin A/C，但这些过程中涉及的详细机制仍不清楚。

基于此，上海交通大学机械生物学与医学工程研究所、北京航空航天大学生物力学与力学生物学教育部重点实验室的专家学者进行了研究，初步表明，泛素降解途径的抑制部分逆转了异常循环拉伸对 lamin A/C 的抑制。然而，这个逆转过程并不完整，这表明还有其他调控机制影响了 lamin A/C 的表达。

因此，研究人员进一步研究，试图证明在异常循环拉伸下 lamin A/C 表达改变的机制，并进一步检测这种表达改变在 VSMC 凋亡中的作用。相关研究成果发表在 Acta Physiologica 题为《Lamin A/C negatively regulated by miR-124-3p modulates apoptosis of vascular smooth muscle cells during cyclic stretch application in rats》。

实验结果：

病理性循环牵张力抑制Lamin A/C的表达并诱导VSMCs凋亡

机械周向应力会因高血压而显著增加，这会导致弹性血管发生更强烈的变形。使用循环牵张力加载系统，在体外对VSMCs 施加不同幅度的循环拉伸。

与5% 的循环拉伸(模仿正常张力的生理拉伸)相比，15% 的循环拉伸(模拟高血压的病理拉伸)显著增加了VSMCs的凋亡，这是通过Annexin V/PI染色(图1A)和裂解的半胱天冬酶 3 ELISA（图1B）检测到的。

此外，还研究了不同程度循环拉伸后 lamin A/C 的蛋白表达情况。与5%-CS相比，15%-CS降低了lamin A(在6、12和24小时)(图1C)和lamin C(在24小时但在6或12小时没有)(图1D)的表达。

这些结果表明病理性升高的循环拉伸诱导了 VSMC 细胞凋亡并抑制了 lamin A/C蛋白的表达。

图 1

抑制 lamin A/C 的表达可诱导VSMCs的凋亡

由于病理性循环拉伸下lamin A/C表达的改变伴随着细胞凋亡的变化，于是检测lamin A/C是否参与了凋亡的调控。

在静态条件下，使用特异性siRNA降低lamin A/C 的表达（图1 E）。静态条件下，敲低Lamin A/C显著增加VSMCs的凋亡 (图1 F、G)。

总之，对拉伸作用下 lamin A/C 表达和VSMC凋亡的研究结果表明，病理性循环拉伸对 lamin A/C 的抑制可能有助于调节VSMC凋亡的。

lamin A/C表达的降低不受转录或自噬的调控

由于 lamin A/C 的蛋白表达在 15%-CS 下降低，实验随后探索了该过程中的潜在机制。虽然初步实验揭示了泛素降解途径在该过程中的部分作用，但进一步检测了 lamin A/C 表达的详细调控机制。

首先，检测了不同程度的循环拉伸对 lamin A/C 的 mRNA Lmna 表达的影响。结果表明，在6、12和24小时，5%-CS和15%-CS组间的Lmna表达无显著差异(图2A)。这一发现表明病理性循环拉伸可能不会改变 lamin A/C 的转录。

此外，还探索了自噬，一种参与lamin B 降解的机械响应性蛋白降解机制，对lamin A/C 表达的影响。两种自噬抑制剂 Baf 和 CQ 均显著抑制了 VSMCs 中的自噬（图2 B、C、F），但对 lamin A/C 的蛋白表达没有显著影响（图2 D、E、G、H ）。然后，检测了 lamin A/C 表达的可能的转录后调控机制。

图 2

miR-124-3p降低lamin A/C的表达

MiRs 是重要的内源性非编码 RNA 分子，通过靶向特定的 mRNA 并诱导其降解或翻译抑制来负调节蛋白质表达。为了识别 lamin A/C 调节中可能的 miRs，对三个在线数据库进行搜索。结果表明，miR-124-3p在Lmna 3'UTR中有两个预测的结合位点(图2 I)，说明miR-124-3p可能负调控lamin A/C 的表达。

随后，miR-124-3p 在 VSMCs 中分别使用特定的模拟物或抑制剂过表达或敲低。蛋白质印迹分析结果表明，miR-124-3p模拟物显著降低 lamin A/C的蛋白质表达（图2 K），而抑制剂增加了lamin A/C水平(图2 L)。这些结果表明 miR-124-3p 在 lamin A/C 表达的调节中起重要作用。

MiR-124-3p 在 Lmna 的 3'UTR 有两个结合位点

使用双荧光素酶报告基因系统评估 miR-124-3p 对 Lmna 3'UTR 的两个独立靶位点的结合和抑制能力。结果表明， Lmna 3'UTR 中的两个靶向位点在 miR-124-3p 下调 lamin A/C 蛋白的表达中很重要。

然后检查了 miR-124-3p 对 VSMC 凋亡的影响，结果显示，miR-124-3p 模拟物显著加速了 VSMCs 的凋亡，抑制物减弱了VSMCs的凋亡。

以上结果表明，miR-124-3p通过靶向Lmna 3'UTR上的两个位点负调控lamin A/C的表达，进而促进VSMCs的凋亡。

抑制miR-124-3p可逆转循环牵张引起的Lamin A/C表达和VSMC凋亡

实验探讨了 miR-124-3p 是否具有机械敏感性，，以及在循环拉伸过程中是否参与调控 lamin A/C 表达和 VSMC 凋亡。与暴露于 5%-CS 相比，暴露于 15%-CS 6、12 和 24 小时显著增加了 miR-124-3p 的表达（图3 A），这表明 miR-124-3p 也是一种机械敏感性分子。与对照组相比，miR-124-3p 抑制剂在 5%- 和 15%-CS 条件下均降低了 VSMCs 的凋亡（图3 B、C、D），同时增加了 lamin A/C 的蛋白表达（图3 E、F)。

这些结果表明 miR-124-3p-lamin A/C 通路参与了 15%-CS 促进的 VSMC 凋亡。

图 3

lamin A/C 的下调可调控 VSMCs 中各种 TFs 的激活

据报道，核被膜 (NE) 蛋白调节 DNA 合成、染色质组织和基因转录。因此，使用 IPA 生物信息学软件寻找可能与 lamin A/C 和 emerin 相互作用的潜在下游转录因子。首先发现了4个由lamin A/C和emerin共同调控的转录因子，然后通过蛋白质/DNA微阵列，发现lamin A/C或emerin的siRNA激活变化均超过2倍。

这些发现表明 lamin A/C 和emerin可调节TFs的活性，TFs可能参与了VSMC凋亡的调控。

高血压在体内诱导miR-124-3p的表达并抑制lamin A/C的表达

使用腹主动脉缩窄高血压模型，在体内探索 VSMCs 的变化。最终结果显示，miR-124-3p/lamin A/C可能参与了高血压引起的异常循环牵张诱导的VSMCs凋亡。

实验结论：

总之，这项研究表明 NE 蛋白 lamin A/C 是 VSMCs 中的机械敏感分子。病理性升高的循环拉伸通过上调 miR-124-3p 抑制 lamin A/C 的表达，进而可能调节不同 TFs 的激活并最终影响 VSMCs 的凋亡。这些结果提供了证据，表明循环拉伸通过 NE 蛋白介导的机制调节 VSMC 的功能，并阐明了核骨架蛋白在机械转导中的作用。

该研究可能为理解高血压 VSMC 功能障碍的机制提供新的见解，并可能为在生理和病理上维持 VSMC 稳态提供一个潜在的靶点。

参考文献：Bao H, Li HP, Shi Q, Huang K, Chen XH, Chen YX, Han Y, Xiao Q, Yao QP, Qi YX. Lamin A/C negatively regulated by miR-124-3p modulates apoptosis of vascular smooth muscle cells during cyclic stretch application in rats. Acta Physiol (Oxf). 2020 Mar;228(3):e13374. doi: 10.1111/apha.13374. Epub 2019 Sep 27. PMID: 31495066.

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