文章题目：Subtype-Specific Prevalence of Hepatitis C Virus NS5A Resistance Associated Substitutions in Mainland China
作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院、金域医学检验中心
发表刊物：Frontiers in Microbiology （if 4.259，2019）
接收时间：2019年3月1日

丙型肝炎防治指南（2019年版）提到：慢性HCV感染者的抗病毒治疗已经进入直接抗病毒药物（DAA）的药物时代，泛基因型方案在已知主要基因型和主要基因亚型的HCV感染者中达到90%以上的持续病毒学应答（SVR），而对于未获得SVR的基因亚型和耐药相关替代突变（Resistance associated substitution，RAS）的感染者，还需要规范的临床试验和精准耐药检测来确定合适的治疗方案。

RASs可能引起HCV DAAs抗病毒效能下降，导致治疗失败。有报道称NS5A RASs可能影响百立泽（达拉他韦）+速维普（阿舒瑞韦）、夏凡宁（雷迪帕韦+索磷布韦）等方案的疗效等。NS5A RASs在不同地理区域的不同基因型之间检出频率不同，基于大部分RASs的研究集中在1型，这篇文章是分享NS5A RASs不同HCV亚型在中国的流行情况。

材料：

1.广州金域医学检验中心收集了2018年1月-6月期间的HCV RNA阳性样本，从这些做HCV基因分型的样本中随机挑选了878例（约1/8）样本用于NS5A RASs检测，所有样本均记录了性别和年龄。878例样本来自中国的27个省，亚型主要为1b：489例，2a：203例，3a：60例，3b：78例，6a：48例。
2. 上海瑞金医院收集了2015年4月-2017年9月期间185例未接受DAAs治疗的HCV 1b样本，其中有52例在样本采集时有过干扰素治疗的记录。 

方法：广州金域的878例样本使用Sanger测序法分析，上海瑞金的185例样本使用Sanger测序和NGS两种方法分析。

 

1.研究人群特征——各亚型在年龄和地域分布不均

年龄分布：与1b和2a相比，3a、3b和6a感染在男性和年轻患者中更常见。

地域分布：2a患者多集中在中国北方，而6a患者多集中在中国东南部。

2.NS5A序列的进化分析

3a序列系统上与来自Los Alamos HCV数据库的35个不同地理来源的参考序列距离较远。Cluster1序列主要来自中国东部，与2004年从泰国分离出的一毒株(HM042074)有关。cluster2序列与2011年从中国分离到的一个毒株(KC844041)的亲缘关系更近，并且表现出混合的地理起源，表明该群集在全国范围内的流行分布。

3b序列呈散在分布，无地理聚类，cluster3主要来自中国东部，但与广西柳州分离的部分毒株具有高度的相似性，表明西南地区的3b型别起源和发展于此，其他地区的分离株可能是其后代。

3.   NS5A RASs在不同亚型的流行率不同

表2中列出了与临床最相关的HCV RASs情况：

在1b序列中（489例），Y93H约占14.1%，Q24、L28、L31、P32、S38、A92的高度保守。R30和P58的多态性更高：分别有17.2%和7%的序列含有Q30和S58的替代。

在2a序列中（203例），95.6%的2a受试者发现了L31M，这表明该氨基酸中的RAS基因频率较高。Y93位未检测到RASs。T24S、F28L、K30R、P58S、C92S所占比例分别低至2.5%、2.5%、1.0%、1.5%、3.0%。

3a的序列中（60例），Y93H仅检测到3.3%，未发现其他RASs。而在3b（78例）中，检测到的A30K和L31M突变比例分别为97.4%和98.7%，但未检测到Y93H。

6a（48例）的Q24K/R、L28F和T58S 的比例分别为18.8%、20.8%、6.3%，但未发现Y93H。

多重RASs可能进一步降低耐药屏障，文章分析了临床重要NS5A RASs在亚型间的重叠率。在1b序列中，未发现28A/M/T/V + 31F/I/M/V的重叠，28A/M/T/V + 93H/N/S(2/489)或31F/I/M/V + 93H/N/S(1/489)频率较低(图A)。但在3b序列(75/78)中，A30K + L31M的共存度极高(图B)。综上所述，1b序列中的Y93H、2a序列中的L31M、3b序列中的A30K和L31M是导致NS5A RASs在中国流行的主要原因（图C）。

4.   1b准种的多样性

在上表列出的RASs中，Y93H主要与所有亚型的NS5A靶向DAA功效降低有关。Y93H多在1b中发现(14.1%)，但在其他亚型中很少见到。Y93和Y93H变异患者在年龄和性别上均无统计学差异，但从区域分布来看，东部地区的患者Y93H频率明显较高(East/non-East, 20.4%/11.0%，p=0.0083)。

为了排除金域的抽样偏差，瑞金医院收集了185例未经DAA治疗的HCV 1b样本，采用Sanger测序和NGS测序两种方法对其NS5A RASs频率进行了测试。Y93H/N/S在NGS平台测到的累积频率为31.9% (1% cutoff)，而Sanger平台的频率为20.5%（与金域数据一致）。但一般认为基线耐药变异的比例较低(＜15%)不会显著影响应答，因此文中使用15%作为深度测序的阈值来报告耐药变异。93H/N/S在1-15%范围内频率为12%，在＞15%范围的频率为19.5%，跟Sanger平台的频率（20.5%）及金域测的频率（14.3%）较接近。28A/M/T/V和31F/I/M/V在1-15%范围的频率分别为7.6%、3.8%，而在＞15%范围比例非常少。另外，所有样本核苷准种归一化香农熵的直方图表明出现93H/N/S的患者HCV复杂性更高。
 

NS5A RASs的流行率可能会根据不同HCV的基因型/亚型和治疗方案而变得多样化。HCV 1b序列中的Y93H、2a的L31M，3b的A30K和L31M是导致NS5A RASs在中国流行的主要原因。对于未经DAA治疗的1b患者，病毒复杂度较高的NS5A 93H发生率也较高。3b患者对NS5A抑制剂具有天然耐药性。基线NS5A RASs的信息可为临床治疗提供指导。由于NS5A抑制剂的重要作用，不同NS5A抑制剂之间的高交叉耐药，以及NS5A抑制剂耐药HCV变异的长期存在，因此基线NS5A RASs的患者在选择DAAs时应谨慎。

本文广州金域的878例样本，上海瑞金的185例样本都使用了Sanger测序，sanger测序法是丙肝分型的金标准方法，可提供被测区域的全部核苷酸序列/遗传信息，可以发现新的基因变异形式，可一次性检测多个位点，可同时检测已知和可能的未知耐药变异位点，假阳性率低等优点，是2019版慢性丙型肝炎防治指南推荐方法。

作者及单位介绍

【谢青】

现任瑞金医院感染科主任、硕士生导师、上海市肝病研究中心专家委员会常务委员、上海市中医药学会感染分会委员、《肝脏》杂志编辑委员会委员。多年来主要从事传染病学专业，尤其是病毒性肝炎的临床和基础研究。目前作为负责人承担了两项国家自然科学基金项目以及一项上海市高校青年科学基金项目。

【上海交通大学医学院附属瑞金医院】

上海交通大学医学院附属瑞金医院成立于1907年，是三级甲等医院。上海瑞金医院感染科先后主持了国家“六五”、“七五”及“八五”攻关课题“重症肝炎发病机制及治疗研究”，取得了许多重大成就。目前瑞金医院感染科，除继续保持了在重症肝炎研究领域的领先优势外；在慢性乙型、丙型病毒性肝炎抗病毒治疗的优化及耐药检测、肝移植术后乙丙型病毒性肝炎的复发、肝细胞损伤分子机制及治疗干预等研究方面都居于全国领先地位。

【金域医学检验中心】

广州金域医学检验集团股份有限公司是一家以第三方医学检验及病理诊断业务为核心的高科技服务企业，金域医学严格遵循国际标准，拥有先进的质量管理体系。截至2018年，共获得包括美国CAP、ISO15189在内的国内外认证认可证书36张，连续16年领先行业。检测结果为全球50多个国家和地区认可。
 

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