标记抗体是免疫电镜样品制备的一种常见方法,该技术由于操作简单、灵敏度高,常应用于IHC,WB,ICC,ELISA等实验。通过标记物的增强放大效应来定位分析抗原,是目前市面上理想的快速价廉的定量检测方法。抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等,还有一些其他的标记方法例如胶体金标记,下面具体来展示抗体标记种类:
1、辣根过氧化物酶(HRP)标记,HRP标记单抗和多抗的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基被氧化成醛基,随后与抗体蛋白的氨基结合,形成Schiff碱。常用的HRP的底物有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等,其中TMB是最常用于 WB、ELISA等实验的底物显色试剂,经HRP作用后由无色变蓝色,目测对比鲜明;加酸停止酶反应后变黄色,可在比色计中定量。云克隆公司ELISA试剂盒中的检测试剂B即为HRP标记的抗体,再与TMB显色底物反应用于定量检测。
2、异硫氰酸荧光素(FITC)标记,FITC是最常用的荧光素,其原理是在碱性条件下,FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合,形成IgG与荧光素的结合物,该荧光被捕捉后即可被检测到,目前市面上这种标记抗体大多被选择作为荧光二抗,可用于免疫组织化学单染或多重染色。通过荧光显微镜或者流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位、定量的检测。
3、生物素(Biotin)标记,现在应用广泛的是生物素-亲合素系统,生物素与亲和素之间高亲和力的牢固结合以及级联放大效应,标记蛋白质这类大分子,再通过显色系统可以定量或者半定量地进行抗原分析。
4、胶体金标记(GICT),蛋白质可与胶体金颗粒通过静电结合从而被吸附到其表面,由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒。由于检测结果直接可以用颜色显示,肉眼判断容易,无需仪器设备,特别适合广大基层单位、医院、野外作业者以及偏远地区等应用。该标记技术已纳入公司的研发项目,广大的科研工作者很快就能获得此类的标记抗体。
5、化学发光标记,使用化学发光剂直接标记抗体,常用的标记发光剂是鲁米诺类,采用增强型的ECL发光体系作为发光底物试剂来实现标记检测,云克隆公司的化学发光试剂盒即采用这一标记技术,用于定量检测相关蛋白等物质。