细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）携带大量的细胞特异性的生物活性分子，核酸、蛋白质、脂类和糖类等，在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用。外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。EVs甚至可能通过携带聚集蛋白传播疾病，如神经退行性变疾病。

 

蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点，是研究外泌体起源的重要途径。蛋白质组学已经逐渐成为研究各种亚细胞组分蛋白质组的重要工具。针对外泌体进行蛋白质组学研究，可以揭示疾病发病机制、寻找疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等。

 

近20年来外泌体蛋白质组学研究发表文章趋势

（数据来源：PubMed，数据至2021年7月）

 

 

外泌体蛋白质组学技术流程

 
外泌体蛋白质组学应用

外泌体中的蛋白质居多，外泌体蛋白质组学应用广泛，研究外泌体蛋白质在免疫调节、抗原呈递、癌症转移、肿瘤浸润、血管生成、神经发育中的生物学功能，标志物的筛选与鉴定、药物靶点的发现以及功能机制中的作用以及疾病诊断、治疗和预后等。

  外泌体蛋白质组学案例分享

案例一：通过定量蛋白质组学鉴定人转移性黑色素瘤组织细胞外囊泡亚群

 

转移性黑色素瘤组织酶处理后，差速超速离心分离出不同大小的细胞外囊泡，然后将其进一步分为高密度（HD）和低密度（LD）部分。然后使用电镜、NTA和TMT定量质谱分析对所有EVs亚种群进行深入分析。

 

TMT定量蛋白质组学结果显示，大型和小型LD EVs均富集了flotillin-1等几种蛋白质，ADAM10仅富集在小型LD EVs中，而mitofilin仅富集在大型EVs中。

 

聚类分析结果表明HD EVs 和LD EVs中蛋白表达差异。

 

案例二：外泌体来源ENO1调节整合素α6β4表达促进肝癌生长和转移

 

α-烯醇化酶（ENO1）在几种人类恶性肿瘤中被发现失调，包括肝细胞癌（HCC）。

 

文章证明ENO1在HCC细胞或组织中上调，在高转移性HCC细胞或转移性组织以及来源于高转移源的外泌体中表达更高。

 

ENO1表达与肝癌患者的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期、分化程度和不良预后有关。ENO1可以通过外泌体介导在HCC细胞之间转移，表现出类似于HCC细胞中ENO1过度表达的效果，其通过上调整合素α6β4表达和激活FAK/Src-p38MAPK通路促进ENO1低表达HCC细胞的生长和转移。

 

 

数据表明，外泌体来源ENO1对于促进肝癌生长、转移和进一步恶化患者至关重要。这项研究发现了一种新的生物标志物用于临床评估肝癌进展，特别是预测肝癌转移风险。

 

通过蛋白质组学分析确定ENO1在LO2exo、HepG2exo、MHCC97Lexo和HCCLM3exo中的表达水平及差异表达。

 

逍鹏生物Dr.Cell 实验室提供外泌体蛋白质组学服务

#TMT，#DIA，#4D Label Free，#Shotgun

 

✦TMT标记定量蛋白组学

 

TMT (Tandem mass tag)是由ThermoFisher Scientific公司研发的一种多肽体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术，采用6、10及16种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，经高分辨质谱仪串联分析，可同时比较多达16种样品之间的蛋白质表达量，是定量蛋白质组学中经典的高通量筛选技术。

 

实验流程

 

技术优势

• 同一批次标记的样本统一处理，减少人为操作和实验系统不稳定造成的偏差，实验平行性较高；

• 同一批次标记定量稳定性高；

• 通过分级方法增加蛋白鉴定深度。

应用领域

• 疾病标志物筛选

• 分子机制研究

• 植物抗逆研究

• 药物作用靶点研究

• 特殊功能蛋白质筛选

 

✦DIA蛋白质组学

 

DIA（data-independent acquisition，数据非依赖性采集）技术是新一代蛋白质组学分析技术，被Nature Methods杂志评为2015年最值得关注的技术。

 

DIA采用数据非依赖性扫描模式：将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，然后对每个窗口中的所有离子进行检测、碎裂，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的信息。从而降低样本检测的缺失值，同时提高定量准确性和重复性，实现大样本队列中高稳定，高精准的蛋白质组定量分析。 

与DDA（data dependent acquisition，数据依赖性采集）技术相比，DIA技术的优势包括：

（1）数据采集更完整；

（2）减少采集的随机性，检测重现性、稳定性更好；

（3）更能检测到低丰度信号。

 

DIA与DDA数据采集模式的区别

 

✦Label free 蛋白质组学

 

Label free是一种不依赖于同位素标记的非标记蛋白组定量技术，通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内标，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

 

TMT、Label Free、DIA如何选择

 

✦Shotgun

 

Shotgun（鸟枪法）是定性鉴定蛋白质混合物中蛋白质组成最常见、最方便有效的方法。

原理

将样本中的蛋白质酶解成肽段，经液相色谱分离进入质谱仪后先记录其一级信号，随后外加能量将其碎裂后再记录其二级信号。采用相应的软件还原样本中的蛋白质组信息。

 

技术优势

可全面鉴定复杂混合样品的大量蛋白质。

 

实验流程

Dr.Cell实验室根据研究者的不同需求，提供差异化的蛋白质组学技术服务。

 

Dr.Cell实验室提供外泌体整体服务方案

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参考文献

• Rossella C. et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.Journal of Extracellular Vesicles. 2020,9:1. 

• Keqiu Jiang. et al. Exosome-derived ENO1 regulates integrin α6β4 expression and promotes hepatocellular carcinoma growth and metastasis. Cell Death & Disease. 2020,11:972.