MaxCyte电转平台助力ExPERT非病毒CAR-T细胞生产工艺突破产业瓶颈
2022-05-26 来源:本站 点击次数:4576CAR-T是当下最受关注的血液肿瘤细胞疗法，如何高效、快速、安全地制备CAR-T细胞，是急待解决的技术瓶颈之一。目前开发一种高效、快速、多功能和安全的基因工具来构建重组T细胞的需求日益迫切，mRNA-CAR被认为是一种快速安全，低成本的解决方案。但通过mRNA转染的CAR基因工程虽然能克服载体风险，但只能提供瞬时表达。德国癌症研究中心的科学家们开发了这种安全快速且持久表达的、非病毒非整合型的DNA载体平台、能够在临床规模的封闭体系中快速制备CAR-T细胞。
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作者整合先进的自动化设备，构建了一套CAR-T细胞生产线路：利用德国美天旎的CliniMacs系统纯化采集的T细胞，利用全自动细胞培养系统， GTx ExPERT (MaxCyte)大规模流式电转系统，能够在5天时间内从10.35 × 109 个血液细胞中纯化出1 × 109 个T细胞，并最终获得3.6 × 108个经过验证具有功能的CAR-T细胞。MaxCyte GTx是符合cGMP规范的电转平台，是真正经过广泛验证的密闭转染平台，容易整合到自动化工业产线中，满足早期研发到临床及商业化全流程，已经支持了全球超过100项细胞和基因治疗临床项目，被Kite、CRISPR、Editas、Sangoma等全球顶尖的生物技术公司采用，如果这一系列最后能够商品化，将必然给CAR-T细胞治疗的开发和推广应用带来巨大深远的影响。
选择nano-S/MARt作为载体
研究人员开发了一种纳米s/MARt (nS/MARt)载体，能在给T细胞活性造成最小的破坏的同时提供稳定的表达。这种新的DNA载体平台是基于支架/基质附着区(S/MAR)基序，可以积极介导有丝分裂活性细胞中DNA载体复制和游离体episome的维持。nS/MARt载体可以有效地转染到原代人T细胞中而不产生毒性。这种新的DNA载体系统是基于无抗生素纳米载体技术;不含免疫原性和成分，只包含临床批准的序列，可实现简单轻松、更具性价比的CAR-T细胞制备。结合研究人员优化的流式电穿孔和自动化的细胞培养，他们还提供了一种适应临床规模的封闭生产流程，最终实现从1×109的T细胞中生产出6×108 的重组T细胞，其中55%能稳定表达CAR，从纯化T细胞起只需5天时间完成！——这将是推动CAR-T细胞疗法朝着更可持续和更普及的方向迈出的重要一步。
实验设计与结果
作者首先选择了一个DNA载体pEPI，去除了非必需元件，将载体从3kb缩小到1.5kb。第一轮改造得到一个功能提高、能在HEK 293T和 HeLa细胞中稳定表达的载体 pS/MARt。然后通过引入剪切位点去掉了来自S/MAR非必需的序列和ARE，获得了更稳定的SP-nS/MARt-B 载体。研究人员再用来自载脂蛋白apolipoprotein B (ApoB)的更紧凑形式S/MAR替换了IFN-β S/MAR，通过实验证实最后版本的SP-nS/MARt-A 纳米载体是最佳的，不但转染效率最高，产生克隆最多，GFP表达最强（转染24小时后）。这还没完，研究人员用来自人EF1α 启动子替换掉了CMV启动子，把最后一点病毒序列也去掉了。在Jurkat76 (J76) 细胞中证实，新载体能持续稳定表达，80%的活细胞都能表达报告基因。更强的是，研究人员分离出表达GFP的细胞，培养360天后依然能检测到GFP稳定表达，每个细胞有1.71个游离性拷贝，超长待机，还不会整合到染色体上。转染细胞和未转染对照细胞的增殖没有明显区别，表明载体对细胞毒性影响很小，也不会改变CD4和CD8比例。用pEPI载体对照转染27天后GFP几乎都消失而SP-nS/MARt-A转染的仍有40%具有GFP表达。这些都表明，新载体用于制备CAR-T细胞应该非常有优势。
在三种异种移植小鼠模型中对新载体进行验证
以CEA为例，研究人员用PGK (phosphoglycerate kinase) 启动子和人癌胚抗原CEA替换掉GFP，构建了SP-nS/MARt-CEA，用电穿孔转染构建CAR-T细胞。与用慢病毒载体比较，新载体CAR表达水平更高，在肿瘤缩小、肿瘤生长延迟、延长生存期，肿瘤浸润率等方面都更优，但两者都没有彻底清除肿瘤，原因是出现肿瘤逃逸，肿瘤细胞抗原丢失。这在临床治疗中很常见。RCA方法检测证实载体以质粒形式存在，没有整合到染色体上。处理40天后将转染细胞与肿瘤细胞混合培养依然显示强大的抗肿瘤活性。另外两种肿瘤模型都显示出新载体制备CAR-T细胞效果优于，至少效果不输给现有方法，而具有持久表达，遗传风险小，制备简单快捷这些优势就更不用说。
为什么选择MaxCyte
实际上在作者建立和优化实验方案阶段，测试了多个电转平台，但科学家们在最终建立的临床规模CAR-T生产工艺中还是选择了MaxCyte ExPERT GTx，主要是看中了MaxCyte电转平台真正用于细胞治疗领域CAR-T临床和商业化中的优越性:（1）超高的转染细胞数，单次转染最高可达2e10 cells；（2）优秀的扩展性，可从少量细胞快速扩展到临床级别所需细胞量；（3）完全封闭的电转流程；（4）操作简单且易于整合进自动化操作流程中；（5）欧美大量细胞治疗企业客户选择并验证过的电转平台。
参考文献：Bozza M, De Roia A, Correia M P, et al. A nonviral, nonintegrating DNA nanovector platform for the safe, rapid, and persistent manufacture of recombinant T cells[J]. Science advances, 2021, 7(16): eabf1333.
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