一、测定意义：

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。本试剂盒采用的 DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探针，是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。当细胞内有活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（Dichlorofluorescein），其荧光在激发波长 488nm，发射波长 525nm 附近有最大波峰，其荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。一般细胞内活性氧的升高是细胞凋亡的标志之一。该活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。

工作波长：最佳激发波长 488，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。

二、试剂组成及保存：

1、0.1mL 10mM DCFH-DA in DMSO，4-8℃保存。

2、1mL 活性氧阳性对照(Rousp,50mg/mL)，4-8℃保存。

三、试剂准备：

1、可将 DCFH-DA 稀释于适宜的缓冲液，如无血清培养液或者 0.01M PBS。对于不同的处理步骤，DCFH-DA工作浓度可为 100nM～20µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1：500～1：1000 以上以避免 DMSO 对细胞的影响，推荐初始浓度为 10µM。另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1:2000~5000 稀释 DCFH-DA，使装载探针时 DCFH-DA 的浓度为 2~5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在 15~60 分钟内调整。

2、阳性对照可以按 1:1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共 1mL，可以加入 1mL 的阳性对照刺激（通常刺激后 20~30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高）。对于不同细胞。活性氧对照的效果可能有较大的差异。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度，反之如果活性氧升高过快则可以适当降低它的浓度。活性氧阳性对照仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。如果用户熟悉 ROS 荧光或实验没有必要采用阳性对照管，如荧光显微镜检测也可以不加该试剂。

四、组织样本操作步骤：
（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）

1、制备单细胞悬液：

方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。

方法 2、酶消化法：

①、选取的组织立即放入预冷的组织培养液或 PBS 中，清洗血迹及其它污染物。去除组织块中的块死成分、纤维、脂肪及血管（专门制备相关细胞时除外）。

②、用眼科剪将组织块剪成 1mm3 左右小块，放在预冷的组织培养液或 PBS 中并进行漂洗，洗去剪碎的细胞碎片。

③、加入适量酶消化液，37℃恒温水浴消化 20～30min，期间进行间断振荡或吹打细胞。

④、用组织培养液或 PBS 终止消化，用 300 目尼龙网过滤除去组织团块，收集滤过的细胞，500g 离心 10min，去上清留沉淀，并用 PBS 洗 1～2 次。

方法 3、机械法（网搓法）：

①、前处理同酶消化法⑴、⑵步。

②、将 300 目尼龙网扎在小烧杯上，将剪碎的组织放在网上，以眼科镊或刮刀轻搓组织块，边搓边用 PBS 冲洗，直至将组织搓完。

③、收集细胞悬液，500g 离心 10min，去上清留沉淀，并用 PBS 洗 1～2 次。

2、加入荧光探针：

①、取不进行任何处理的细胞用 0.01M

PBS 重悬，设为阴性对照管。阳性对照管：用稀释好的 DCFH-DA 重悬细胞沉淀，同时加入活性氧供氢体诱导细胞。

②、样本管：用稀释好的 DCFH-DA 重悬细胞沉淀，细胞密度一般要求 1×106-2×107/mL。

③、37℃孵育细胞 30min～几小时，每隔 3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针与细胞充分接触。通常为 20～60min即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件以及 DCFH-DA 浓度有关。

④、收集孵育（探针标记）后的单细胞悬液，1000g，离心 5～10 分钟，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 洗涤 1～2 次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。离心收集细胞沉淀用于荧光检测；

3、荧光检测：本试剂盒仅用于科研、实验室

①、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测；

②、波长设置：最佳激发波长 488nm，最佳发射波长 525nm。也可按 FITC 荧光检测条件检测。

③、结果以荧光度值表示。

五、细胞样本操作步骤：
（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）

1、直接将探针加入培养液中(该方法只适用于贴壁细胞)：

①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1：1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA(终浓度为 10µM)。去除培养液后，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1mL。

②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同时加入活性氧供氢体诱导细胞。

③、37℃孵育细胞 20min～几小时（每隔 3~5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触），通常为 20min，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 20~30 分钟后，即可观察到明显的绿色荧光。

④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。

⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5mL 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。

⑥、波长设置：最佳激发波长 488nm，最佳发射波长 525nm。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。

⑦、结果以荧光度值表示。

2、先收集细胞，制备成细胞悬液后测定(该方法适用于贴壁细胞及悬浮细胞)

①、细胞收集：

a、贴壁细胞，吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察孔板底部(瓶底)由半透明(细胞单层连接成片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。

b、将细胞悬液全部收集到 1.5mL 离心管中。用无血清培养液或者 0.01MPBS 洗涤 2 次，1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，留细胞沉淀用于测定。

c、悬浮细胞按照常规方法离心(2000rpm/min，离心 5min)，收集细胞沉淀，用无血清培养液或者 0.01M PBS 洗涤 2次，1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，留细胞沉淀用于测定。

②、细胞重悬：细胞密度一般要求 1×106-2×107/mL，一般有两种方法：

a、先加入无血清培养液或者 PBS 重悬细胞，然后根据加入培养液或者 PBS 的体积，按照 10µM 的初始浓度(最好做预实验确定自身样本适合浓度)加入探针，(适用于预实验及少量样本的情况)

b、先按照 10µM 的浓度将探针用无血清培养液或者 PBS 先稀释好，然后用稀释好的探针重悬上述细胞沉淀，制备成细胞悬液，(适用于样本较多的情况)

③、取一份不加探针，只加入培养基或 PBS 的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞悬液，同时加入活性氧供氢体诱导细胞。

④、37℃孵育细胞 20min～几小时，通常为 20～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关；每隔 3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针与细胞充分接触。

⑤、收集孵育（探针标记）后的单细胞悬液，1000rpm/min，离心 5min，吸净上清，用 PBS 洗涤 1～2 次，离心收集细胞沉淀物用于荧光检测。

⑥、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测。

⑦、波长设置：最佳激发波长 488nm，最佳发射波长 525nm。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。

⑧、结果以荧光度值表示。

六、相关注意事项

1、悬浮荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景不干净荧光值偏高。

2、重悬的细胞密度可根据细胞的荧光强弱进行调整，如荧光较强可将细胞密度调小，如荧光较弱可将细胞密度调大，但所有样本的细胞密度应保持一致。

3、测定细胞样本时，对于药物作用时间在 2 小时以内的细胞，一般建议先标记探针，然后再用药物刺激细胞，对于药物作用时间需要在 6 小时以上的细胞，可以先用活性氧阳性对照及药物刺激细胞，然后再标记探针。

4、同时取部分单细胞悬液经过超声或匀浆破碎处理，用于蛋白的测定（蛋白定量试剂盒本所有售，推荐 A045-2考马斯亮蓝法蛋白定量试剂盒、A045-3 BCA 法蛋白定量试剂盒），用于结果计算表示为荧光度值/毫克蛋白。

5、荧光一般是用荧光发射的强度，不过由于不同的仪器表示方法不一样，有的用光能量，有的用光子计数，不同的仪器测定值之间没有可比性，一般都用相对值表示。因此其单位是任意单位(Arbitrary Unit，AU)。