CD3/CD28单抗偶联磁珠可持续刺激T细胞及多篇案例分享
2022-08-29 来源:本站 点击次数:9221一、T细胞激活关键“CD3”
一般而言，双特异性抗体具有耐受良好（CRS相对较低）和通用性等优点，因此如何对双特异性抗体改造，在不损害现有优势的条件下并提高其疗效是双特异抗体开发的一个重点方向。目前，在开发的双特异抗体管线中，超过一半的双抗均是通过CD3靶点来激活T细胞，从而对肿瘤细胞进行杀伤进而达到治疗癌症的目的。
CD3分子分布于成熟T淋巴细胞表面，至少由γ、δ、ε、ζ、η5种多肽链组成，与T细胞抗原受体非共价连接。CD3单克隆抗体可诱导CD3多肽和TCR共帽形成（co-capping)，并诱导T淋巴细胞活化。TCR识别外来抗原与自身MHC分子形成的复合物，CD3对于信号的传递具有重要作用。由于拥有独特的生物学机理，双特异性抗体已经成为抗体药物研发领域的一个重要分支，也是当下制药行业最热门的研发和投资方向之一。根据相关信息统计，目前全球有超过180种双抗处于临床开发阶段，约260种双特异性抗体处于临床前开发阶段，其中，CD3是双抗药物研究的主要靶点[2]
二、T细胞激活关键“CD28”
CD28作为一种共刺激因子，具有两种最显著的功能：
（1）T细胞活化的辅助信号：抗CD28可加强PHA、ConA、抗CD2McAb、抗CD3McAb等增殖、活化的效应，增加IL-2、IL-3、TNF-α、IFN-β、GM-γ、GM-CSF等细胞因子产生，激活CTL细胞。此外，抗CD28McAb可诱导T细胞IL-13mRNA的表达；
（2）CD28的天然配体是B细胞活化抗原B7/BB1（CD80），CD28与CD80的结合是T-B细胞相互协作的主要方式，并刺激B细胞活化。
在外周血淋巴细胞，CD28+细胞占比达到54～86%，其中90%的 CD4+ T细胞和50%的 CD8+ T细胞表达CD28。CD28在CD28+ T细胞中表达与功能有一定的关系，CD8+CD28+ T细胞表现出MHC限制的细胞毒性功能，而CD8+CD28- 细胞可抑制抗体产生以及同种异体抗原所诱导的细胞增殖效应。此外，浆细胞瘤及部分活化的B淋巴细胞也可表达CD28。
三、T细胞增殖关键“IL-2”
值得一提的是，IL-2是γ受体细胞因子家族中第一个被鉴定的细胞因子，它最初是从活化的人类T细胞培养上清中发现的，是一种介导T细胞增殖的可溶性因子。IL-2也是FDA批准用于癌症治疗的第一种细胞因子。虽然在抗原刺激下主要由CD4+和CD8+T细胞分泌，但活化的树突状细胞（DC）、肥大细胞和NKT细胞也产生少量的IL-2。IL-2能刺激T细胞和NK细胞的增殖和活化、诱导B细胞免疫球蛋白合成和支持细胞毒性效应细胞分化，因此，在培养T细胞的时候，适量加入IL-2，会有不错的效果。
四、T细胞活化增殖能手——CD3/CD28单抗偶联磁珠
bsAB从20世纪80年代提出作为新兴人工合成抗体分子，可以同时特异性识别和结合两种及以上不同的抗原和表位。CD3、CD28作为T细胞激活的两个重要靶点，在体外联合使用CD3、CD28抗体刺激T细胞，可以模拟体内T细胞活化双信号作用。使用CD3/CD28单抗偶联磁珠可以提供T细胞激活与扩增所需的主要信号和协同刺激信号，利用CD3/CD28免疫磁珠进行磁性细胞分离，CD3+T细胞得到有效分离和富集。CD3+T细胞在4.5μm左右的磁珠条件下培养，与细胞大小完美匹配，模拟APC高效激活扩增T细胞。研究表明，CD3/CD28单抗偶联磁珠可持续刺激T细胞，远远超出单用CD3/IL-2刺激倍数，并且能保留更多T细胞记忆表型，增加疗效时长。
总而言之，利用抗CD3的抗体提供第一信号，抗CD28抗体刺激提供共刺激信号，来使T细胞充分活化，这使得CD3/CD28单抗偶联磁珠逐渐成为目前市场上的主流选择。
研究案例一
在CD3为核心的双抗药物开发方面，2019年，赛诺菲的研发人员以CD28靶点对CD3为核心的双抗注入活力为突破点，率先给出了答案。他们通过CD3双抗联合CD28的三特异性抗体疗法，在抗肿瘤研发方面取得了突破性进展[3]。
CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC（抗原递呈细胞）上的B7分子结合，介导被CD3分子传递的第一信号激活后的T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。
在T细胞的激活过程中，需要TCR/CD3结合到MHC-多肽，同时需要第二重共刺激信号进一步激活。因而在CD3双抗基础上，激活CD28有望进一步提升抗肿瘤活性。因此，赛诺菲的研究人员在传统以CD3双抗的基础上加入CD28单抗，形成同时靶向CD38/CD3/CD28的三特异性抗体。
从功能上来看，三特异性抗体分工明确。CD38为肿瘤表面抗原，其也可以是其他肿瘤相关抗原，用于特异性识别识别肿瘤细胞；CD3作为T细胞共受体，用于激活细胞毒性T细胞和T辅助细胞，并介导T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤；CD28分子则是TCR/CD3复合物的共刺激分子，促进T细胞活化，且这种增强的T细胞活化驱动了T细胞的增殖以及T细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达。
此外，根据近些年国内的其他研究发现，CD3和CD28具有协同免疫性，利用CD3/CD28协同刺激T淋巴细胞，可使T淋巴细胞充分活化，能极大地提高T细胞的扩增量与存活率。
研究案例二
据2006年中国解放军总医院输血科骆群等人开展的“抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β(肿瘤生长因子beta)的表达”研究结果表明：在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的激活时间明显提高，并有效促进T淋巴细胞分泌TGF-β[4]。
另外，通过对T细胞活力保持度与绝对数量的科研实验表明：细胞利用CD3/CD28磁珠刺激后，T细胞可在第4天后快速扩增，并且扩增情况可持续到第14天，其活力保持在90%以上[5]。
研究案例三
以Gary J. Nabel博士为核心的科研团队发表在Nature杂志上的一篇论文中显示：他们制备了一种由HER2、CD3和CD28组成的三特异性抗体，分别用以靶向、激活T细胞和延长T细胞的生存时间。[6]
实验结果显示，CD3和CD28结合位点的失活显著抑制了T细胞活性，表明这两个结合位点对T细胞活化和增殖具有重要作用。此外，他们在体外杀伤试验中发现该抗体能够介导T细胞以抗原特异性的方式杀伤HER2+乳腺癌细胞。
HER2/CD3×CD28三特异性抗体不同臂在体外免疫激活中的作用
研究案例四
2022年5月14日，上海惠和生物三特异性抗体CC312的IND申请获FDA默示许可，是国内首个也是全球第三个基于CD28共刺激信号的三特异性抗体进入临床研发阶段。其通过以“双信号”调控机制活化T细胞，对效应细胞的激活作用更持久，并可诱导T细胞分化成记忆性T细胞，延长药物的作用时间，改善临床给药模式。双抗在肿瘤免疫治疗中存在三个重要作用机制——免疫细胞桥接、免疫细胞激活、双信号通路阻断，而三抗的出现使抗体的组合更加丰富多样，能促进靶细胞与效应细胞的相互作用，从而增强药物对癌细胞的杀伤能力。
总结：T细胞的活化是个非常复杂而精细的过程，现在仍然有一些关键通路并未研究透彻。随着CD3/CD28单抗偶联磁珠其作用机制的“红盖头”掀开，以及三抗药物的临床试验获批，我们相信未来CD3/CD28单抗偶联磁珠将在T细胞扩增以及“万物可CAR”的江湖里面继续扮演重要的角色，为肿瘤的“降服”提供更加强大的助力。
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参考文献：
[1] Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A. & June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 365, 725–733 (2011).
[2] Siwei N , Zhuozhi W , Maria M C , et al. Biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics[J]. Antibody Therapeutics(1):1.
[3]Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation；
[4]骆群，吕明，于鸣，黎燕，抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达.中国实验血液学杂志.10.3969/j.issn.1009-2137.2006.03.029
[5]Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003 Apr 1;275(1-2):251-5. doi: 10.1016/s0022-1759(03)00010-3.
[6]Seung E, Xing Z,Wu L,etc. A trispecific antibody targeting HER2 and T cells inhibits breastcancer growth via CD4 cells. Nature. 2022 Mar;603(7900):328-334. doi:10.1038/s41586-022-04439-0. Epub 2022 Feb 23. Erratum in: Nature. 2022 Mar 24;:PMID: 35197632.