导论
乳糖操纵子（ lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因，负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调控是分子生物学中一个研究较为充分的系统。DNA 结合蛋白（ lacI）是控制乳糖操纵子的关键因子。该系统的平衡解离常数（  K_D）通常估计在 nM 范围内。

在这篇应用笔记中我们将分享蒙特利尔大学实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力， K_D）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR分析，以便在本科实验课程中演示该生物系统。
 

图 1：乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白结合

实验过程

系统设置

图 2：台式 P4SPR 设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。S形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供三个重复样品的测量以及与一个参考通道的控制测量。通过透明通道可以直接观察在通道中是否有气泡行成，以便立即清除从而防止任何信号丢失。
 

图 3：P4SPR 微流体单元

实验步骤

图 4：实验流程图

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。形成强金-硫键后， 当 SPR 表面饱和后产生平台信号。然后注射互补的 LacO 寡聚体进行杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。通过先前储备的蛋白母液来制备 5, 20, 50, 100 和 200nM 的蛋白分析物溶液。依次注入逐渐增加浓度的溶液，并用大量洗涤溶液和再生缓冲液孵化 10 分钟， 用于除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有 4 个通道的数据，然后导出到 Excel 中进行进一步的数据分析。

结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。对该信号进行平均后，从参考通道信号中减去来得到 SPR 信号相对于时间的信号图（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 K_D（图 6）。计算的  K_D为 6.4± 1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录抑制蛋白的文献报道值¹。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比， SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测。

图 5：关于不同浓度的 LacO 随时间变化的 SPR 信号
 

图 6：叠加 Lacl 浓度增加的结合曲线

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式， 便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR工具。它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外， P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地检测乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可通过之前发表的文献验证。本科生可从该实验熟悉 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。此外， P4SPR 系统也可研究其他生物系统，如 DNA-DNA， RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合作用并揭示其在生物系统中的功能。

致谢
我们要感谢 Philipe Lampron， Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 Sébastien Truche 开发该技术。

关于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité Instruments 的创始人在 SPR 领域积累了十多年丰富的研究经验，并通过多元化的商业，科学和工程领域经验将创新的 SPR技术商业化。

¹Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities ofengineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation.

doi: https://doi.org/10.1101/477893