植物成像应用：过氧化氢感受器过程中所使用的钙成像方法研究
2022-11-21 来源:本站 点击次数:7699
（注：因HPCA1属于LRR-RK受体激酶亚家族，在上篇文章中，我们并未对其在“受体”或“感受器”上的称呼做严格限定，鉴于相关植物学研究领域老师的指正，我们遵照裴老师文章中出现频率较多的sensor这一描述，将HPCA1称为过氧化氢的“感受器”或“传感器”，特此说明。）
在本篇文章中，我们从原文的庞大实验体系中重点选取与细胞内Ca2+成像相关的实验与发现为大家做详细介绍，以期可以为进行类似研究的老师们提供思路和方法学上的参考。
eH2O2诱导的[Ca2 +] i增加缺陷型突变体（hpca1）的筛选实验过程中，研究人员使用基于Ca2+成像的正向遗传筛选法，对植物体内的胞浆钙浓度（[Ca2 +] i）进行测量，进而分离得到eH2O2诱导的[Ca2 +] i增加缺陷型突变体（hpca1），用于后续研究。具体的实验过程如下：
使用组成型表达细胞内Ca2 +指示剂水母发光蛋白（pMAEQUORIN2）的Col-0品系拟南芥植株，于成像前12h均匀地施加3 ml 10 µM腔肠素（水母发光蛋白的作用底物）。筛选出可稳定表达水母发光蛋白的M2种子后，对培养的幼苗使用4 mM H2O2处理3min，在此期间连续进行水母发光蛋白的信号采集（Ca2+成像），进而筛选出对H2O2所诱导的[Ca2 +] i增加不敏感的拟南芥幼苗，作为hpca突变体候选株进行单独收集。
对照实验：将图1a中使用的野生型和hpca1拟南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液处理（刺激水母发光蛋白发光），对剩余的发光总量进行成像以及定量。结果显示，野生型和hpca1幼苗中的水母发光蛋白总量相似，说明图1a中，hpca1幼苗的生物发光减弱与其水母发光蛋白的含量无关，确实是由于对H2O2的响应存在缺陷而导致。
与其他两类突变体相比，hpca1突变体对H2O2具有特异性
为了确定hpca1突变体与已知的渗透压osca1和盐敏感型moca1突变体相比，对H2O2具有特异性，研究人员将它们并排生长并检查其各自的Ca2 +表型。
验证hpca1基因的突变是导致eH2O2感知缺陷的原因
利用全基因组重测序的方法对HPCA1进行鉴定，发现其为一种富含亮氨酸的重复受体激酶（LRR-RK）。为了证明hpca1基因的突变是导致eH2O2感知缺陷的原因，研究人员将HPCA1和hpca1突变体进行互补性重组，并对重组后的幼苗用4mMH2O2处理后进行Ca2+成像，结果表明HPCA1可以“拯救”hpca1突变体表型，说明hpca1正是导致缺陷型的基因。
HPCA1是否适用于其他LRR-RK传导机制的探究
另一方面，研究人员想要探究HPCA1对于H2O2是否具有特异性，或HPCA1是否更普遍地适用于其他LRR-RK传导机制——感知生物刺激并触发NADPH氧化酶介导的H2O2生成。
鞭毛蛋白肽flg22和延伸因子Tu（EF-Tu）衍生的肽elf18和elf26都是与微生物相关的分子模式（MAMPs）。在先天性免疫中，MAMPs的受体通常是受体激酶，如LRR-RKs、FLS2和EFR分别是flg22和elf18-elf26的受体。flg22和elf18-elf26均可引起[Ca2 +] i增加，这在其相应的受体突变体fls2和efr中则被消除。
研究人员分析了HPCA1是否可以区分MAMPs处理后产生的H2O2，发现在hpca1突变体中，由flg22触发的[Ca2 +] i增加不受影响。FLS2及其共受体BAK1的突变体对flg22触发的[Ca2 +] i增加表现出缺陷，但对于eH2O2诱导的[Ca2 +] i增加则表现出野生型水平。
考虑到保卫细胞中抗过氧化氢1（ghr1）突变体在eH2O2和ABA信号传导中均表现出强表型，研究人员对hpca1和ghr1突变体也进行了比较，发现eH2O2诱导的[Ca2 +] i增加在ghr1突变体中不受影响。
这些结果表明，保卫细胞中的eH2O2信号传导涉及多个LRR-RK，HPCA1可能是GHR1上游的eH2O2传感器。
HPCA1的胞质结构域具有激酶活性
为确定HPCA1的胞质结构域（HPCA1CD）是否具有激酶活性或仅充当支架结构，研究人员准备了野生型HPCACD以及三种无活性的激酶突变体：HPCA1（K659E）CD——与ATP结合相关，HPCA1（D773L）CD——与催化相关，HPCA1（Q856 *）CD——结构域被截短。
利用这三种激酶突变体构建的HPCA1与hpca1-2突变植株进行互补性重组，发现这些激酶突变体不能恢复hpca1-2的表型，说明HPCA1的胞质结构域（HPCA1CD）发挥激酶活性的作用。
HPCA1在其胞外区域具有2个特殊的Cys残基对，为了探究这2个残基对的作用，研究人员使用Cys突变的HPCA1对hpca1突变体进行互补重组，对重组后的样本使用4mM H2O2处理。
Ca2+成像结果显示，Cys突变的HPCA1无法恢复hpca1-2突变体的表型，说明胞外Cys残基对对于感应eH2O2是必不可少的。
图5 | Cys突变的HPCA1 × hpca1-2突变体中，Ca2+成像发光信号大幅度减弱，即Cys突变的HPCA1无法恢复hpca1-2突变体的表型。
扩展数据图6：
对照实验：将图5e中使用的各组拟南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液处理（刺激水母发光蛋白发光），对剩余的发光总量进行成像。对于所有基因型，检测到相似的发光强度。说明图5e中Cys突变的HPCA1 × hpca1-2突变体的发光信号大幅度减弱与其水母发光蛋白的含量无关，而是由于其对H2O2的响应存在缺陷而导致。
基于水母发光蛋白生物发光的Ca2+成像过程由配备了不透光暗箱的超低温背照式CCD相机（ChemiPro HT系统）以及配备了H-800不透光可控环境箱的新型Lumazone系统（(Pylon1300B）完成。将液氮自动填充系统连接到成像系统以提供恒定的冷却温度。CCD相机由WinView软件控制，并使用MetaMorph 6.3等软件进行生物发光图像的分析。
注：ChemiPro HT系统、Lumazone Pylon1300B系统、液氮自动填充系统以及WinView控制软件均由Roper Scientific以及Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）提供。
H-800不透光可控环境箱由Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）独家研发，适用于植物活体成像过程中对于实验植株的培养与拍摄，可控制温度和光照强度，提供稳定均一的生长和实验条件。
MetaMorph 6.3（Molecular Devices, USA）等图像分析软件由Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）提供。
设备使用期间，由北京博益伟业仪器有限公司负责提供钙离子成像、图像分析软件、环境控制培养箱、CCD液氮制冷装置等相关部分的技术支持和售后服务工作。
除了采用基于水母发光蛋白生物发光的Ca2 +成像技术进行相关研究外，研究人员在实验过程中还采用了基于黄色Cameleon 3.6（YC3.6）的Ca2+成像方法，用以评估hpca1突变体中保卫细胞eH2O2 Ca2+信号传导受损的情况。实验方法描述如下：
将hpca1突变体杂交到组成型表达Ca2 +传感器YC3.6的野生型植株中并进行Ca2 +成像，对产生的五个以上的纯和品系进行分析。之后，将来自三周龄植株的莲座叶表皮置于含有100μM CaCl2、5 mM KCl和10 mM MES-Tris（pH 6.15）的微孔室中，在光照下放置2.5 h。
使用配备有两个滤光轮（Lambda 10-3 / 10-2）和低温CMOS或CCD相机（Prime sCMOS / CoolSNAPfx）的荧光显微镜进行比率式Ca2 +成像。在440 nm处进行激发，并使用MetaFluor软件（Molecular Devices）收集发射比率为F535 nm / F485 nm的图像。
考虑到eH2O2触发了保卫细胞中[Ca2 +] i的增加和气孔的关闭，实际检测时，确实可以在hpca1突变体中观察到保卫细胞内的eH2O2 Ca2 +信号降低，并且响应eH2O2的气孔关闭数量减少。
这些结果表明，在hpca1突变体的保卫细胞中，eH2O2所诱导的Ca2 +信号通路存在明显缺陷。
对照实验：将图5e中使用的各组拟南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液处理（刺激水母发光蛋白发光），对剩余的发光总量进行成像。对于所有基因型，检测到相似的发光强度。说明图5e中Cys突变的HPCA1 × hpca1-2突变体的发光信号大幅度减弱与其水母发光蛋白的含量无关，而是由于其对H2O2的响应存在缺陷而导致。
基于水母发光蛋白生物发光的Ca2+成像过程由配备了不透光暗箱的超低温背照式CCD相机（ChemiPro HT系统）以及配备了H-800不透光可控环境箱的新型Lumazone系统（(Pylon1300B）完成。将液氮自动填充系统连接到成像系统以提供恒定的冷却温度。CCD相机由WinView软件控制，并使用MetaMorph 6.3等软件进行生物发光图像的分析。
注：ChemiPro HT系统、Lumazone Pylon1300B系统、液氮自动填充系统以及WinView控制软件均由Roper Scientific以及Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）提供。
H-800不透光可控环境箱由Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）独家研发，适用于植物活体成像过程中对于实验植株的培养与拍摄，可控制温度和光照强度，提供稳定均一的生长和实验条件。
MetaMorph 6.3（Molecular Devices, USA）等图像分析软件由Bio-One Scientific Instrument（博益科学仪器）提供。
设备使用期间，由北京博益伟业仪器有限公司负责提供钙离子成像、图像分析软件、环境控制培养箱、CCD液氮制冷装置等相关部分的技术支持和售后服务工作。
除了采用基于水母发光蛋白生物发光的Ca2 +成像技术进行相关研究外，研究人员在实验过程中还采用了基于黄色Cameleon 3.6（YC3.6）的Ca2+成像方法，用以评估hpca1突变体中保卫细胞eH2O2 Ca2+信号传导受损的情况。实验方法描述如下：
将hpca1突变体杂交到组成型表达Ca2 +传感器YC3.6的野生型植株中并进行Ca2 +成像，对产生的五个以上的纯和品系进行分析。之后，将来自三周龄植株的莲座叶表皮置于含有100μM CaCl2、5 mM KCl和10 mM MES-Tris（pH 6.15）的微孔室中，在光照下放置2.5 h。
使用配备有两个滤光轮（Lambda 10-3 / 10-2）和低温CMOS或CCD相机（Prime sCMOS / CoolSNAPfx）的荧光显微镜进行比率式Ca2 +成像。在440 nm处进行激发，并使用MetaFluor软件（Molecular Devices）收集发射比率为F535 nm / F485 nm的图像。
考虑到eH2O2触发了保卫细胞中[Ca2 +] i的增加和气孔的关闭，实际检测时，确实可以在hpca1突变体中观察到保卫细胞内的eH2O2 Ca2 +信号降低，并且响应eH2O2的气孔关闭数量减少。
这些结果表明，在hpca1突变体的保卫细胞中，eH2O2所诱导的Ca2 +信号通路存在明显缺陷。
图6 | a：在加入2 mM H2O2之前的20秒和之后的140秒，每4秒钟拍摄一次表达YC3.6的植株中表皮条的比例图像。b：根据a中实验的时间进程，对[Ca2 +] i进行量化分析。
注：低温Prime sCMOS相机、CoolSNAPfx CCD相机（Photometrics, USA）和MetaFluor软件（Molecular Devices, USA）均由Bio-OneScientific Instrument（博益科学仪器）提供。
设备使用期间，由北京博益伟业仪器有限公司负责提供相应的技术支持和售后服务工作。
总结：
作为生物体内一种重要的信号传导介质，Ca2+具有独特的生物学功能，参与多种细胞对于外部刺激的感应以及内部分子事件的调控过程。裴真明教授课题组的研究人员，采用基于生物发光蛋白（水母发光蛋白）以及荧光蛋白钙指示剂（YC3.6）的Ca2+成像方法，完成了在发现植物细胞表面过氧化氢感受器HPCA1过程中所涉及的多项探究任务，如利用正向遗传筛选法分离得到突变体植物、验证目标植株、目标基因和目标蛋白的特异性等。成像方法的应用，使得结论的得出及证明过程更加简便、高效和直观。因此，我们特意梳理出上述涉及Ca2+成像的实验方法与大家做交流，希望从事相关植物学研究的老师们可以对这些技术方法有更进一步的了解，对于今后开展相关研究有所助益。
注：低温Prime sCMOS相机、CoolSNAPfx CCD相机（Photometrics, USA）和MetaFluor软件（Molecular Devices, USA）均由Bio-OneScientific Instrument（博益科学仪器）提供。
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总结：
作为生物体内一种重要的信号传导介质，Ca2+具有独特的生物学功能，参与多种细胞对于外部刺激的感应以及内部分子事件的调控过程。裴真明教授课题组的研究人员，采用基于生物发光蛋白（水母发光蛋白）以及荧光蛋白钙指示剂（YC3.6）的Ca2+成像方法，完成了在发现植物细胞表面过氧化氢感受器HPCA1过程中所涉及的多项探究任务，如利用正向遗传筛选法分离得到突变体植物、验证目标植株、目标基因和目标蛋白的特异性等。成像方法的应用，使得结论的得出及证明过程更加简便、高效和直观。因此，我们特意梳理出上述涉及Ca2+成像的实验方法与大家做交流，希望从事相关植物学研究的老师们可以对这些技术方法有更进一步的了解，对于今后开展相关研究有所助益。
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北京博益Bio-one成立于2004年，一直专注于生物样本库建设、植物活体分子标记成像系统、三维活体小动物荧光断层成像技术、大分子与细胞膜表面受体相互作用等领域，致力于为科研用户提供更新的技术与服务。自2006年，我们开始参与农业种子基因库与临床样本库的设计与施工，积累了13年的4°C、-20°C、-80°C、液氮温区库等管理与维护经验；同时，自2008年开始，成像事业部追踪最新的活体成像技术，不断完善细胞-组织-活体的成像解决方案。欲了解上述领域内更多最新的技术文献与资讯，欢迎您关注此公众号或访问本司官网 http://www.bio-one.cn。
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