基因编辑调控技术之细胞转染的分类、途径、实验流程及影响因素

2022-12-06 来源:本站点击次数:2204

转染——是将外源基因如DNA、RNA导入真核细胞的技术。是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源基因而获得新的表型的过程。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产等领域中，转染技术的应用越来越广泛。

图1 转染

转染的分类

根据外源性基因在真核细胞中表达时间的长短我们可将转染技术可分为瞬时转染和稳定转染(永久转染)两种。在瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制，适用的核酸类型主要包括质粒DNA、siRNA、miRNA和mRNA。细胞瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的，先对细胞进行转染，再对得到的细胞进行筛选，在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。适用的核酸类型只有质粒DNA，且外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。

图2 瞬时转染和稳定转染的区别

常规细胞转染的途径

1．化学介导法

主要是使用载体分子去中和或者使带负电的核酸带正电荷，让核酸更容易进入细胞内。主要包括DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法等。

化学介导法	原理	主要应用	特点
DEAE-葡聚糖法	带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞	瞬时转染	相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1、CV-1、COS细胞系
磷酸钙法	磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞	稳定转染、瞬时转染	不适用于原代细胞(所需的DNA浓度较高)，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。细胞建议用CSCL梯度离心，转染时拷贝数较多
人工脂质体法	带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合	稳定转染、瞬时转染	使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
阳离子聚合物	带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞	稳定转染、瞬时转染所有细胞	除了具有阳离子脂质体的转染效率高、操作简单、适用范围广、重复性好等特点外，还具有在体内、转染效率高、细胞毒性低等特点，是新一代的转染方法

2．物理介导法

物理介导法是将核酸直接递送到细胞质或细胞核中。主要包括电转染、显微注射法、基因枪法。

物理介导法	原理	主要应用	特点
电转染	通过高脉冲电压破坏细胞膜电，DNA通过膜上形成的小孔导入细胞内	稳定转染、瞬时转染所有细胞	适用性广，除了质粒外还可转染大的基因组(>65kb)，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少只有1-20
显微注射法	用显微操作将DNA直接注入靶细胞核	稳定转染、瞬时转染	转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
基因枪法	将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放、表达	稳定转染、瞬时转染	可用于的细胞类型有：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞

3．生物介导法

又称之为病毒介导法，是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。病毒介导法转染效率很高，尤其是针对难转染的活体细胞、原代细胞。主要包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等病毒介导法。

生物介导法	病毒基因	原理	主要应用	特点
慢病毒	RNA病毒	包装系统由包装成分和载体成分组成。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制的慢病毒载体颗粒。包装好的病毒颗粒可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子	稳定转染特定宿主细胞	可以感染分裂期和非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。
逆转录病毒	RNA病毒	通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞，之后反转录酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中	稳定转染特定宿主细胞	可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大(<8kb)，细胞需处分裂期，需考虑安全因素
腺病毒	双链DNA病毒	先和细胞表面的受体结合，继而被细胞内吞	瞬时转染特定宿主细胞	可用于感染分裂期和非分裂期细胞、难转染的细胞，需考虑安全因素

图3 细胞转染的途径

细胞转染相关实验

图4 细
胞转染流程图

以质粒DNA为例介绍细胞转染的流程(24孔板、贴壁细胞、核酸转染试剂盒(货号：abs60259))：

实验材料

1.1仪器设备

CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、细胞计数仪等。

1.2试剂耗材
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸缓冲溶液(PBS)、胰酶、核酸转染试剂盒(abs60259)、24孔板、1.5ml无菌离心管若干等。

实验步骤

Step1 细胞接种:

1．转染前一天对细胞进行转接，每孔接种1.5-2.0×10⁵个细胞，使转染时细胞密度为90%左右，且生长良好(非常重要)；

2．最好在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致细胞死亡。

Step2 试剂A/DNA转染复合物制备(该步完成后应立即进行转染):

1．在1.5 ml无菌离心管A中加入50µl无血清培养基，再加入适量的转染试剂A，见下表8。用移液器轻轻混匀后在室温静置5分钟。

2．在1.5 ml无菌离心管B中加入50µl无血清培养基，并加入适量的试剂B，轻轻混匀，再加入适量的DNA，见下表8。用移液器再次轻轻混匀后在室温静置5分钟。

3．将DNA-培养基混合物滴加至试剂A-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后，立即转染。

注意： 1. 试剂A-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。

2. 离心管最好使用聚丙烯离心管。

Step3 转染:

1．将Step2制备的转染复合物滴加至培养基中，边加边轻轻晃动培养板以使复合物均匀分布。加完后，立即将培养板转入培养箱继续培养。

2．培养12小时后即可观察，最佳观察或收获时间为24~48小时。

3．试剂A在完全培养基中仍有较高的转染效率，因此转染前后不需要换成无血清或低血清培养基。

培养皿		96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	10cm皿
培养基、试剂、DNA量	无血清培养基(μl)	2x10	2x25	2x50	2x100	2x200	2x1000
	试剂A(μl)	0.5	1.3	2.5	5	10	50
	试剂B(μl)	0.4	1	2	4	8	40
	1ug/ul plasmid(μl)	0.16	0.4	0.8	1.6	3.2	16
完全培养基		0.1	0.25	0.5	1	2	10

表5 质粒转染不同培养体系推荐初始转染条件

影响细胞转染效果的因素
(1) 细胞密度

细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。阳离子脂质体试剂具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞达到90%汇合度；而研究细胞周期等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。一般转染时贴壁细胞密度大致为50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书。

(2) 细胞生长状态

这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代、生长状态良好的细胞系。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛,最容易转染。

(3) 细胞种类、转染试剂、转染方法

不同细胞种类的细胞在做转染时转染效率通常不同，因此所需要的转染体系是不同的，不能一种转染体系用在所有类型细胞的转染实验。实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都有不同的转染方法，但大都大同小异，同时目前产品都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。另外，在大规模使用前，仍需进行转染试剂和核酸最优比例的实践摸索。

(4) 核酸类型及质量

用于转染的核酸类型一般有质粒DNA、mRNA 、sirNA和miRNA，针对不同的核酸一般采用不同的转染试剂和转染方法。另外在制备高纯度DNA时，还需要对DNA进行内毒素的去除，内毒素的存在会造成细胞毒性，严重影响转染效率。同时DNA质量对转染的效果影响也非常大，一般转染技术是基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带有污染物都会显著影响转染复合物的的形成。

图6 细胞转染图

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