免疫共沉淀Co-IP实验流程及文献中的结果解读
2023-01-04 来源:本站 点击次数:6571What is Co-IP？
Co-IP全称Co-Immunoprecipitation，中文学名免疫共沉淀，是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。
通俗点来说，假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用，首先我们通过合适的方法处理样本，将蛋白提取出来（同时不能破坏蛋白之间的相互作用），然后用预先结合了琼脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗体捕获样本中的A蛋白，那么与A蛋白结合的B蛋白也能一起沉淀下来。再将蛋白从珠子上裂解下来，对B蛋白进行检测，能检测到，说明B蛋白在之前的沉淀过程中随着A蛋白一起被拉下来了，进而证明二者之间存在相互关系。
How to do？
各名称解析：
IB：全称immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。
IP：全称immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input：全细胞裂解液，含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体
IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG
结果图解析：
该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。本实验一共分为两大组：Input组及IP组，其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。由Input组的条带可以得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。
确切来说，试剂盒的50T代表着能够完成50次免疫沉淀反应，而实际上免疫共沉淀实验需要设置多个组别进行对照验证，因此具体能够完成多少次Co-IP实验由设计方案决定，一般至少需要设置阴性对照、阳性对照、实验组三个组别。
这个步骤的目的是为去除样本中可与protein A/G琼脂糖珠非特异结合的蛋白质，减少干扰，非必做，如CoIP实验中发现有较多杂带，可考虑做一下；但应注意，选择此步骤后，需要消耗琼脂糖珠，后续能够进行免疫沉淀的次数也相应减少。
首先需要排除lgG和后续WB一抗同源导致的轻重链的干扰条带（25kd和50kd附近）；再者建议进行预清除实验以排除Protein A/G的非特异性结合；再就是考虑lgG的问题可以换用其他品牌lgG尝试。
※ 出现假阳性结果该怎么排除？
假阳性结果需要设置对应的阴性对照组一一排除，假设实验组为琼脂糖珠+抗体X+靶蛋白X+抗体Y+目的蛋白Y：
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可能出现假阳性结果的成因 |
对照组设置 |
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琼脂糖珠与X蛋白发生非特异结合 |
琼脂糖珠+抗体X+抗体Y |
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琼脂糖珠与Y蛋白发生非特异结合 |
琼脂糖珠+蛋白Y |
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抗体X和目的蛋白Y非特异性结合 |
琼脂糖珠+抗体X+蛋白Y |
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抗体的非特异性结合 |
IgG+蛋白X+蛋白Y |
※ 最后的实验结果是阴性的，是否能说明两个蛋白之间无相互作用？
对于内源性Co-IP实验，阴性结果不能百分百说明无相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致，因此建议先做过表达Co-IP作为对照。