几种PCR方法概述及其优点
2023-01-10 来源:本站 点击次数:413
一、反向PCR
反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
二、不对称PCR
不对称PCR是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物低浓度引物消耗完后，非限制性引物高浓度引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。
三、重组PCR
使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR，1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子.其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增.其产物将是一重组合的DNA.重组PCR主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体）。
四、多重PCR
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
五、免疫PCR
免疫试验的主要步骤有三个:
①抗原抗体反应，
②与嵌合连接分子结合，
③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA一般为质粒DNA该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为:
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上。
②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测。
③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。
反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。
二、不对称PCR
不对称PCR是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物低浓度引物消耗完后，非限制性引物高浓度引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。
三、重组PCR
使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR，1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子.其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增.其产物将是一重组合的DNA.重组PCR主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体）。
四、多重PCR
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
五、免疫PCR
免疫试验的主要步骤有三个:
①抗原抗体反应，
②与嵌合连接分子结合，
③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA一般为质粒DNA该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为:
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上。
②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测。
③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。
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