子宫内膜是子宫的黏膜内层，它在整个生殖生命周期中经历脱落、再生和分化的动态、周期性变化。子宫内膜功能异常常引发许多疾病（包括异常子宫出血、不孕症、流产、先兆子痫、子宫内膜异位症和子宫内膜癌），这些疾病极大的影响了女性健康。因此，绘制人类子宫内膜时空动态图谱、研究人类月经周期中调节细胞分化的机制显得尤为重要。

       2022年1月，来自英国剑桥大学的研究人员们在国际权威期刊Nature genetics上发表了题为 mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro 的研究论文，该文利用了10 x Genomics 公司的高通量scRNA-seq和Visium空间基因表达解决方案，绘制了人子宫内膜细胞的时空图谱，为后续人类攻克子宫内膜异位症以及子宫内膜癌等子宫内膜相关疾病奠定了坚实的理论基础。


文章结果

1. 人类子宫的全层单细胞图谱

      为了生成人类子宫内膜细胞的时空图谱，研究者通过使用10x Genomics的单细胞转录组学和空间转录组学方法（Visium）来分析所有的子宫样本。来自 15 个个体的 98,568 个细胞进行降维聚类分析后得到14个簇，并分成五种主要的细胞类型。来自另外四个增殖期子宫内膜全层样本的 snRNA-seq 数据证实了在增殖期发现的细胞群体。同时研究者使用 Visium 空间转录组测序技术检测了两个个体的增殖期和分泌期的四个全层子宫样本。
       整合单细胞和空间转录组测序数据后，研究者发现PVSTEAP4仅存在于子宫内膜中，而成纤维细胞 C7 在增殖期和分泌期都富含于子宫内膜的基底层中。总之，本研究得到了子宫的全层单细胞图谱及其在子宫内膜和子宫肌层中的细胞位置的综合图谱。

2. 子宫内膜上皮细胞的时空图谱

       子宫内膜上皮细胞可被分为两个谱系，即分泌型和纤毛型。上皮细胞根据其标志物表达分为四个主要群体：（1）SOX9 细胞群 (2)纤毛细胞(3) 管腔细胞 (4) 腺细胞 ；scRNA-seq 可将SOX9细胞群细分为三个细胞亚群。通过整合 scRNA-seq 和 Visium 数据，研究者定义了SOX9 三个子亚群的空间信息，利用RNA scope 探针做的单分子荧光原位杂交实验（smFISH）验证了 Visium 数据。


3 子宫内膜疾病中的 SOX9+ 上皮细胞 

      利用TCGA 数据库中的bulk RNA 测序数据，研究者发现SOX9+上皮细胞群在肿瘤中占主导地位。基于上皮细胞中的表达信号，子宫内膜腺癌被分为了三种模式，子宫内膜腺癌的晚期阶段（III 期和 IV 期）具有更强的SOX9+LGR5+信号。
       总之，本研究分析表明功能失调的上皮细胞是子宫内膜疾病的主要驱动因素。 通过分析两个 SOX9 细胞群体的转录组，我们得到在子宫内膜癌和子宫内膜异位症中占主导地位的特定细胞信号。

4、微环境对上皮细胞分化的影响

       通过分析整个月经周期中调节上皮细胞分化的转录因子及其靶基因的表达，结果表明 NOTCH 和 WNT 通路在调节分泌和纤毛细胞谱系分化中的不同作用。参与 WNT 通路的基因FOXJ1和LGR5在腔表面高度表达，而NOTCH2在功能层的腺体中富集。研究者进一步使用免疫组织化学结合 smFISH 实验对结果进行了验证。
       研究者开发了 CellPhoneDB v.3.0，该升级版本在映射配体-受体对时会考虑空间细胞共定位。根据单细胞和空间的联合分析确定了三个以上皮细胞为中心的子宫内膜微环境，在每个微环境上运行 CellPhoneDB，发现显著的上皮-基质相互作用。此外，蜕膜基质细胞表达的DKK1（WNT通路的抑制剂）显著高于非蜕膜基质细胞，在空间转录组学中也发现了围绕分泌内皮腺体的DKK1的表达。总之，这些发现表明 WNT 信号是在分泌细胞谱系中被抑制，NOTCH信号将占主导地位。


5、子宫内膜类器官对卵巢激素的反应

       研究者进一步通过在单细胞水平上分析子宫内膜类器官来检测 WNT 和 NOTCH 信号通路在体外对子宫内膜上皮细胞的潜在作用。通过单细胞实验数据证实类器官对激素的反应与体内相似，卵巢激素在体内和体外都激活了相似的途径。为了测试 WNT 和 NOTCH 通路在纤毛和分泌细胞分化中的作用，研究者在 NOTCH 或 WNT 抑制剂存在的情况下培养类器官，使用组织学和单细胞转录组学来分析表明，在 NOTCH 抑制剂存在下，有较高比例的纤毛细胞和较低比例的分泌细胞。当 WNT 被抑制时纤毛细胞几乎不存在，分泌细胞的比例增加。

总结

       本文生成了人类子宫的单细胞和空间细胞图谱以及子宫内膜类器官，这些将提高对常见疾病（包括不孕症、子宫内膜异位症和子宫内膜癌）中发生的分子和细胞异常的理解。本文剖析了决定管腔和腺体微环境中上皮细胞的信号通路，揭示了在体内和体外调节分泌和纤毛细胞分化的途径。WNT 或 NOTCH 通路的体外下调分别增加了分泌和纤毛细胞的分化效率。研究人员利用这个细胞图谱来解读了来自子宫内膜癌和子宫内膜病变的群体数据，阐明了这些疾病中占主导地位的细胞类型。这些结论为未来开发包括子宫内膜异位症和子宫内膜癌等常见疾病的治疗方法提供了一个理论支持。


参考文献：
Garcia-Alonso, Luz, et al. “Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and invitro.” Nature Genetics 53.12 (2021): 1698-1711.

     
附：子宫内膜组织解离原理

      在组织样本离体后24h内进行组织解离 ，进行两步酶消化处理；首先用胶原酶处理子宫内膜组织以回收基质部分，随后经过滤把保留在 100 μm 过滤器上的组织片用胰蛋白酶处理以富集上皮部分。

详细实验步骤如下：
一. 用胶原酶解离子宫内膜
1. 配制混合胶原酶液。
2. 刮掉组织上残存的血管。注意：如果供体被灌注，我们可以跳过这一步。
3. 用 PBS 清洗组织{可选}。
4. 将湿纸巾放在培养皿下，取 2 把手术刀，将组织大致切碎。
5. 将切碎的组织转移到含有胶原酶混合物的 50 mL裂解管中（~ 3 毫升/组织，取决于组织的大小）。
6. 拧紧盖子，然后用封口膜密封。
7. 在 37 °C 下孵育45min ，孵育中要摇匀组织。
8. 用 20 mL 10%的RPMI 重悬组织。
9. 使用小孔过滤器 (100um) 过滤样品——不要丢弃滤膜上残留的组织，残留的组织将用于“子宫内膜-胰蛋白酶”方案。
10. 已过滤得到的样品以 450 g 离心5min。
11. 用 10 mL 的 PBS 洗涤两次。
12. 用 1 mL RPMI 10% 重悬细胞，计数细胞并分选细胞群（请参阅流式细胞术和分选的“细胞”染色方案)。


二、接下来对滤膜上残存的组织进行-胰蛋白酶处理
1. 配制胰蛋白酶处理混合液。
2 .按照“用胶原酶解离子宫内膜”方案的第 9步，将组织碎片保留在细胞过滤器上。通过将过滤器倒置到新的 50 mL 管中并用 1 mL 移液器加入 45 mL PBS溶液 来收集保留在过滤器上的碎片。
3.与上一步胶原酶处理后得到的样品混合在一起后，以 450 g 离心5min，弃去上清液。
4. 用 10 mL 0.25% 的胰蛋白酶/EDTA溶液重悬碎片，并在 37 °C 下摇动孵育20min 。
5. 加入 20 mL含 10% FBS 的 RPMI。
6. 缓慢且小心地将样品通过 100 μM 的滤膜（此时是非常稠密的液体），丢弃滤膜上残留的组织。
7. 在 4℃下，以 500 rcf 离心5min，弃去上清液。
8 .{可选} 用 5 mL的 RLB 混合物重悬样品并孵育 10min。
 *RLB溶液的制备：用水稀释 10x RLB 原液 ；RBC 裂解后，加入 10 mL 1 的 PBS 并以 500 rcf 离心 5min；
9. 用 1 mL PBS溶液 重悬细胞。
10. 在 4℃下，以 500 rcf 离心5min，弃去上清液。
11. 用 250 μL的 PBS 重悬细胞（最终体积取决于细胞数）
12. 使用细胞过滤器过滤细胞。
13. 使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。