自噬是一种进化上保守的机制，有助于真核细胞维持平衡和更新。它参与调控了多个重要的细胞过程，包括维持细胞干性、促进胚胎发育、形成固有免疫，并影响衰老和长寿。传统的观点认为，自噬是蛋白质水平上的一系列细胞质事件，但近年来的证据表明，细胞核转录和表观遗传调控也对这一过程有深远的影响。

在细胞适应因营养缺乏及其他代谢紊乱引起的代谢变化时，自噬也发挥着关键的作用。一些营养传感器被证明可以调节自噬，从而维持细胞代谢和能量稳态。然而，m⁶A等表观转录组修饰在饥饿诱导自噬的调节中发挥什么作用，目前还不清楚。

近日，南方医科大学等机构的研究人员在《Nature Communications》杂志上发表论文，首次揭示了m⁶A阅读器YTHDF3作为营养反应器调节自噬诱导的作用和机制，为RNA转录后修饰应对营养缺乏应激的范式提供了新见解。
 

图片来源：Nature Communications

研究材料与方法
在这项研究中，研究人员使用了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。利用赛业生物提供的YTHDF3^+/−小鼠，他们构建了YTHDF3^−/−小鼠胚胎。在整个实验过程中，他们使用了基于LC-MS的蛋白质组分析、RNA免疫共沉淀测序分析（RIP-seq）和MeRIP-seq分析、免疫荧光染色和自噬流分析等。他们还通过LC-MS/MS和m⁶A斑点印迹测定了m⁶A修饰水平。

技术路线
01 通过蛋白质组学分析发现饥饿状态下的YTHDF3蛋白水平升高
02 通过RNA干扰实验证实YTHDF3上调是自噬所必需的
03 在分析m⁶A水平后发现饥饿处理提高了m⁶A修饰水平，而YTHDF3需要METTL3介导的m⁶A修饰来促进自噬
04 通过RIP-seq和MeRIP-seq等分析发现FOXO3是YTHDF3促进自噬的关键功能靶点
05 YTHDF3与FOXO3 mRNA终止密码子附近的m⁶A修饰位点结合，然后招募eIF3a和eIF4B来促进FOXO3翻译

研究结果
1.YTHDF3上调是自噬诱导所必需的
为了鉴定与自噬相关的表观转录组分子，研究人员对营养缺乏状态下的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）开展了蛋白质组学分析。有趣的是，他们发现m⁶A阅读器YTHDF3的水平显著升高。

为了分析YTHDF3诱导是否与自噬发生有关，他们利用shRNA载体来敲低MEF中的YTHDF3的表达，发现自噬标志物LC3-II水平下降，而自噬受体蛋白p62积累，表明自噬流降低。挽救实验表明，YTHDF3的异位表达能够提高LC3-II水平，并加快p62降解。他们还利用赛业生物提供的YTHDF3^+/−小鼠繁育YTHDF3^−/−小鼠胚胎并获得了YTHDF3^−/− MEF细胞，发现YTHDF3缺失导致MEF细胞中自噬体和自噬性溶酶体数量大幅减少。这些数据表明，YTHDF3上调是营养缺乏期间的自噬诱导所必需的。此外，后续的分析表明，YTHDF3缺失损害了自噬体形成和溶酶体功能。

2.YTHDF3需要m⁶A修饰来促进自噬
考虑到YTHDF3是m⁶A阅读器，研究人员接着探索了YTHDF3是否需要m⁶A修饰来促进自噬。他们发现，m⁶A修饰在营养缺乏时显著增加，表明mRNA的m⁶A水平在自噬诱导期间升高。在分析m⁶A修饰的书写器（负责添加修饰）和擦除器（负责去除修饰）后，他们发现只有书写器METTL3在营养缺乏后显著升高（图1）。
 

图1 YTHDF3需要METTL3介导的m⁶A修饰来促进自噬^[1]
 

图2 YTHDF3识别饥饿诱导的FOXO3 mRNA的m⁶A高甲基化^[1]

之后，通过进一步的分析，研究人员发现YTHDF3的作用可能是调节FOXO3的翻译，而不是FOXO3的翻译后修饰（如磷酸化）。他们发现，YTHDF3以METTL3依赖性的方式调节FOXO3的表达，并改变FOXO3靶向的自噬基因的表达。他们还在YTHDF3缺陷型细胞中异位表达了FOXO3，发现LC3-II的表达得到恢复，p62逐渐降解。这些结果表明，FOXO3是YTHDF3促进自噬的关键功能靶点。

4.YTHDF3促进FOXO3的翻译，但不影响其mRNA的稳定性
研究人员发现，敲低YTHDF3并不影响FOXO3 mRNA的水平，表明YTHDF3可能对FOXO3的翻译有影响。YTHDF3已被报道通过与40S和60S核糖体亚基相互作用促进RNA的翻译，于是他们开展了多聚核糖体分析，发现在YTHDF3缺陷型细胞中，FOXO3 mRNA在多聚核糖体中的水平低于对照细胞，表明YTHDF3缺失减弱了FOXO3翻译。通过突变分析，他们进一步确认了FOXO3-CDS终止密码子附近的m⁶A位点在YTHDF3促进FOXO3翻译时发挥关键作用。同样地，FOXO3-3’ UTR区域终止密码子附近的m⁶A位点也参与了FOXO3翻译调节。

翻译控制通常发生在起始阶段。在开展co-IP LC-MS/MS分析后，研究人员注意到多个翻译起始因子与YTHDF3存在相互作用。其中，eIF3a和eIF4B是营养缺乏时最明显富集的。通过不同核糖体组分的Western blot分析和分子对接模型分析，他们认为eIF3a、eIF4B和YTHDF3之间很可能存在蛋白质相互作用。在敲低eIF3a或eIF4B后，FOXO3蛋白水平降低，表明YTHDF3可能与eIF3a和eIF4B相互作用来促进FOXO3翻译。

研究结论

图3 YTHDF3诱导自噬的可能机制^[1]

总的来说，这项研究揭示了表观转录组学与自噬之间的重要关联。一系列的证据表明，m⁶A阅读器YTHDF3作为营养反应器，与FOXO3 mRNA终止密码子附近的m⁶A修饰位点结合，然后招募eIF来迅速促进FOXO3翻译，并进一步从转录上激活一系列核心自噬基因，从而促进自噬（图3）。

原文检索：
[1] Hao, W., Dian, M., Zhou, Y. et al. Autophagy induction promoted by m⁶A reader YTHDF3 through translation upregulation of FOXO3 mRNA. Nat Commun 13, 5845 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32963-0

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品系名称：
C57BL/6N-Ythdf3^em1Cya
品系编号：
KOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
产品编号：
S-KO-06231
应用方向：
信号转导,RNA剪接,蛋白质代谢,RNA结合蛋白,代谢研究,生理系统
打靶方案：

YTHDF3 Flox小鼠

品系名称：
C57BL/6N-Ythdf3^em1(flox)Cya
品系编号：
CKOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA
产品编号：
S-CKO-07230
应用方向：
代谢研究,蛋白质代谢,信号转导,RNA剪接,RNA结合蛋白
打靶方案：