补体系统

补体是存在于人和动物血清与组织液中的一组激活后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应的球蛋白。补体系统是由30余种蛋白质组成的复杂的网络，属于人体先天免疫系统的一部分。正常情况下，补体系统激活后，介导一系列的细胞反应，如溶胞、调理吞噬、炎症反应、清除免疫复合物等，协助人体免疫系统抵御病原入侵和感染。但是补体系统的不适当调节或激活则会对组织器官造成损伤，引发包括眼部疾病、自体免疫疾病、哮喘、癌症、溶血性疾病等多种常见病和罕见病。
 

补体系统主要由固有成分、调节蛋白及受体组成。补体固有成分以非活性状态广泛存在于血液中，被激活时会按照一定顺序，以级联反应依次进行激活，并发挥一系列生物学效应。补体系统可通过经典途径 (抗原-抗体复合物结合C1q启动)、旁路途径 (又称替代途径，由细菌、真菌或外源异物直接激活) 和凝集素途径 (又称MBL途径，由甘露聚糖结合凝集素MBL识别并结合病原微生物表面的糖结构启动) 三种途径激活。三种途径的激活起始物和前端反应各异，但相互联系并在C3转化酶处汇合，进入共同的末端通路，即生成C5转化酶将C5裂解成C5a和C5b, C5b与C6、C7和C8结合，在目标细胞表面形成C5b-8复合物，之后与12~15个C9分子结合形成膜攻击复合物 (MAC)。当足够数量的MAC插入目标细胞膜时，形成亲水性穿膜孔道介导目标细胞快速渗透性裂解。

补体成分C5和C5药物

C5是补体激活的共同组分之一，它是一种190 kDa的糖基化的β球蛋白，在正常人血清中约为75 µg/ml (0.4 µM)。成熟的C5是一个由999个氨基酸的115kD α链与655个氨基酸的75kD β链二硫连接的异构体。C5由C5转化酶裂解生成C5a (10.4 kD) 和C5b (179 kD)，C5a是一种强效过敏毒素和趋化因子，C5b参与形成末端膜攻击复合物。

 

由于补体系统失衡涉及多种疾病的发病机制，所以针对补体系统的药物开发逐渐受到关注，其中靶向C5及其相关受体的药物最多。Alexion Pharmaceuticals 专注于补体药物研究和开发领域。2007年，Alexion公司的人源化抗人C5单克隆抗体Eculizumab (衣库珠单抗，商品名Soliris®) 被批准用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH) 和非典型溶血性尿毒症 (aHUS)。Eculizumab特异性地与人C5蛋白结合，阻断强效促炎性蛋白C5a的生成，并进一步阻断末端补体复合物的形成。Eculizumab治疗可减少PNH患者的血管内溶血，并降低aHUS患者的补体水平。2018年，Alexion又上市了长效C5补体抑制剂Ravulizumab (商品名Ultomiris®)，能有效降低游离的C5水平，并且只需每隔8周给药一次，极大地改善了患者的生活。Alexion公司研究人员采用Gyrolab® 技术建立了定量分析人血清中游离补体成分C5的检测方法，并申请了专利“A Method of Quantitating Unbound C5 In A Sample (WO 2018/075758 A1)”, 本文就这一检测方法做相关介绍。

 

1. 传统ELISA法检测游离C5的缺陷

 

在接受Eculizumab治疗的患者血清中存在与药物结合的C5 (Eculizumab-C5 复合物) 和未结合的游离C5，因此在以药物作为捕获试剂的ELISA检测中，在样品孵育时捕获试剂可以与基质中的Eculizumab-C5 复合物建立动态平衡，根据Biacore结果，在基于多孔板的ELISA检测中，大约15%的Eculizumab-C5复合物在60分钟内解离 (ka~l.le⁶(1/Ms), kd=4.6e^-5(1/s), 25°C），所以检测可能高估基质中的游离C5水平从而导致潜在的不准确的建模、剂量选择、申报数据和标签声明。在这种情况下，检测中的样品孵育时间、稀释、温度、样品以及检测方法的浓度范围等都成为影响结果的关键因素。通常缩短孵育时间、减少稀释、冰浴降温等有助于减少药物-C5复合物解离。

 

2.  Gyrolab检测游离C5

 

Gyrolab在微流控CD上进行小型化的免疫检测，配体结合在亲和柱上进行。试剂和样品通过毛细作用加入到微流控通道中，然后在离心力作用下快速流穿亲和柱，没有孵育步骤且试剂和基质的接触时间非常短，基质中与药物结合的C5 很难发生解离并再次与被用作捕获抗体的药物结合。此外，Gyrolab检测动态范围很宽, 可以使用同一稀释度对药物治疗前和治疗后的患者样品进行检测。因为治疗前的样品中游离C5水平远远高于治疗后的样品，宽动态范围足以覆盖这两种情况下的预期分析物浓度时，就不必针对每种情况下的样品进行不同的稀释，降低了样品处理误差。

Gyrolab检测方法：

• Gyrolab xPand/Gyrolab xPlore, Bioaffy 200 CD (200 nL)

• 捕获抗体：生物素化Eculizumab或ALXN1210 (Alexion公司候选抗C5药物)，用PBST配制成100 µg/mL的工作浓度。

• 检测抗体：Alexa Flour 647®标记的小鼠抗人C5抗体N19-8，用Rexxip F缓冲液 (Gyros) 配制成1 µg/mL的工作浓度。该抗体与捕获抗体识别C5上的不同表位，因此不会与捕获抗体竞争结合C5。

• 未知样品：接受抗C5抗体药物 (Eculizumab或ALXN1210) 治疗前和治疗后的患者血清样本，均用Rexxip A 缓冲液 (Gyros) 以1:30稀释，MRD 30。

• 标曲样品：纯化的重组人C5蛋白以300 µg/mL的浓度添加到去除C5的人血清基质中，然后3X梯度稀释：300、100、33.3、11.1、3.70、1.23、0.41、0.14、0.045、0.015和0.005 µg/mL。0.005 µg/mL作为锚定点。然后用Rexxip A缓冲液以MRD30进行稀释。

• QC样品：纯化的重组人C5蛋白以240、10和0.045 µg/mL的浓度添加到去除C5的人血清基质中，然后用Rexxip A缓冲液以MRD30进行稀释。ULOQ (300 µg/mL) 和LLOQ (0.015 µg/mL) 以同样的方式配制。

• 洗涤缓冲液：Bioaffy Wash Buffer 1 (PBST), Bioaffy Wash buffer 2 (pH 11, Gyros) 

 

3.  Gyrolab检测结果与性能

 

使用以上方法检测人血清中游离C5的动态范围为0.015-300 µg/mL，这一动态范围和样品稀释度 (1:30) 覆盖了预期的样品浓度，无论是患者接受药物治疗前血清中可能高达200 µg/mL的游离C5水平，还是治疗后血清中低于0.5 µg/mL的水平。使用ALXN1210作为捕获试剂的检测性能见表1：

表1：QC样品的检测性能 (2天，4次独立运行)

选择性是靶点生物标志物检测一个重要的参数。在10个供体血清样品中添加50 µg/mL的纯化人C5标准样品，因为血清样品中已经存在内源性的C5，故可考察检测方法的选择性。表2为Gyrolab对10个加标血清样品的检测结果，显示Gyrolab检测法准确地测量了添加到含有内源性对应物的样品中的纯化C5标准物质。

表2. Gyrolab选择性 (10个供体样本，ALXN1210作为捕获试剂)

 

4.  Gyrolab检测 vs ELISA检测

在人血清样品中添加不同浓度的Eculizumab和ALXN1210药物，两组加标样品均用ELISA法和Gyrolab法同时检测，表3和表4分别为ELISA和Gyrolab检测的结果。在每组添加药物的样品中，Gyrolab的检测结果都较低，表明几乎没有结合型的C5从血清中的药物中被拉出来(being pulled)并与捕获试剂结合, 而在ELISA检测中，由于发生了结合型C5解离的现象，导致检测结果高估了游离C5水平。

表3 . ALXN1210和Eculizumab加标血清样品中游离C5的ELISA检测结果

 

表4.  ALXN1210和Eculizumab加标血清样品中游离C5的Gyrolab检测结果

 

5.  Gyrolab检测 vs ECL检测

 

研究人员还建立了电化学发光免疫分析ECL (MSD) 检测人血清中游离C5的方法，该方法动态范围为0.0274 - 20.0 µg/mL，治疗前血清样品MRD为20，治疗后血清样品MRD为2，下表为MSD与Gyrolab两种检测方法的比较：

总结

Alexion 公司研究人员为补体药物开发建立了Gyrolab检测方法测定人血清中的游离补体C5蛋白。该方法检测动态范围为0.015-300 µg/mL，宽动态范围允许对患者接受药物治疗前和治疗后游离C5水平差异极大的血清样品以相同的稀释度 (MRD) 进行测量，避免了对不同批次样品进行不同稀释的要求并减小了因稀释不同而造成的样品处理误差。Gyrolab检测是在亲和柱上以流穿模式 (Flow-through) 进行配体结合，试剂与样品接触时间短且没有孵育步骤，大大降低了作为捕获试剂的药物与血清中已经与药物结合的C5达到动态平衡的可能性，使得对血清中真正游离的C5蛋白的定量检测更准确和可靠。Gyrolab检测法使用的样品量非常少，仅需4 µL，并且分析速度快，约1小时完成一张CD运行，产生112个数据点。数据表明该方法具有良好的选择性和平行性。

参考文献：
A Method of Quantitating Unbound C5 In A Sample (WO 2018/075758 A1)

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Gyros Protein Technologies AB 由成立于2000年的Gyros AB和成立于1985年的Protein Technologies, Inc.合并而成，其别具一格的生物分析和多肽合成解决方案可以帮助科学家提高科研、药物发现、临床前和临床研究以及生物工艺应用中的生物分子性能和生产力。在生物制药行业，Gyros Protein Technologies公司的纳升级自动化免疫分析工作站（Gyrolab® xPand和Gyrolab xPlore™）和多肽合成仪（PurePep® Chorus、Symphony® X和PurePep® Sonata®+）拥有大量且不断增长的应用，加速了更安全、更有效的生物治疗药物、细胞基因疗法和疫苗等的发现、开发和生产。Gyros Protein Technologies是Mesa Labs的一个部门。如需获取详细信息，敬请访问https://www.gyrosproteintechnologies.com