利用Octet解决AAV定量的痛点问题
2023-03-10 来源:赛多利斯 点击次数:1572
上新了·Octet！解锁新技能，轻松玩转AAV定量
腺相关病毒 (Adeno-associated viruses, AAV) 作为一种基因递送工具，具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点，是目前基因治疗中的首选载体，包括天然型（AAV）和重组型（rAAV）在内多种血清型。常用的AAV血清型有AAV1，2，5，6，7，8，9，rh10等，不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构，由于其组织特异性（或亲嗜性）不同而被广泛应用。
图1. AAV载体疗法占在研病毒载体基因疗法的约80%
图2. 不同血清型组织递送特异性
AAV关键质量属性评估
之病毒颗粒数
2022年5月，国家药监局药审中心发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》通告，病毒颗粒数是重要的质量分析指标之一。全新推出的Octet® AAVX腺相关病毒定量生物传感器（货号：18-5160），消除目前定量方法通量低、成本高、耗时长的技术瓶颈，一键解锁各类血清学AAV病毒衣壳定量！
AAV定量痛点
Octet® AAVX定量解决方案
特异性高，动态范围广
Octet® AAVX传感器对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10等10种不同的AAV血清型具有良好特异性。
图3. Octet® AAVX对10种AAV血清型的特异性结合
大多数血清型的动态范围在8.5x108至1.0x1013 vp/mL之间，线性范围跨越5个数量级，无论高滴度和低滴度样品都能得到准确测量。且动态范围内测试的所有浓度均观察到良好的回收率 (80–120%) 和精密度 (CV<10%)。
图4. 使用Octet® AAVX生物传感器对纯化的AAV9衣壳定量
轻松消除基质干扰，粗样品表现优异
AAV的整个生产流程会用到不同的缓冲液和培养基基质，Octet® 对纯化样品和粗制样品均表现出优异的处理能力。使用样品稀释剂缓冲液对粗样品进行4倍至10倍稀释，即可显著减轻样品中基质效应。
点击了解不同血清型和
基质类型最小稀释系数
图6. 使用Octet® AAVX生物传感器对AAV9粗样品衣壳定量（含 1% Pluronic F-68的裂解缓冲液，稀释比例3:1；n=3）。结果显示浓度为3.05x109–2.22x1012 vp/mL。样品回收率在95–105%之间，并且受测浓度具有良好的精密度（CV<10%）。
与ELISA相关性
Octet® BLI搭配AAVX传感器可以实现快速的检测设置、分析和实时数据显示，从而能够监控和优化每个检测步骤。为了证实Octet® AAVX检测法和ELISA之间的相关性，来自BridgeBio Pharma和REGENXBIO公司的研究人员在AAV生物工艺流程的不同步骤测试了样品中的不同AAV血清型。
图7. 使用Octet® AAVX生物传感器和ELISA定量检测纯化样品及粗制样品（生物工艺中间体）中的AAV8和AAV9，数据显示两种方法具有良好的相关性。数据由REGENXBIO Inc.提供。
图8. 使用Octet® AAVX生物传感器和ELISA定量检测AAV生产上游和下游不同步骤中的AAV5（包括纯化样品及粗制样品）滴度。滴度范围为6.73x109至9.59x1013 vp/mL，证明Octet® AAVX检测法与ELISA之间具有良好的相关性。数据由BridgeBio Pharma, Inc.提供。
简单便捷，全面优化
*与Octet® AAVX对比
总结
基于Octet® BLI 和Octet® AAVX 生物传感器的AAV定量检测策略可广泛应用于AAV 上游和下游工艺各阶段，优化传统终点法耗时费力的确定，提供可靠、准确且便捷的AAV定量新思路。
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腺相关病毒 (Adeno-associated viruses, AAV) 作为一种基因递送工具，具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点，是目前基因治疗中的首选载体，包括天然型（AAV）和重组型（rAAV）在内多种血清型。常用的AAV血清型有AAV1，2，5，6，7，8，9，rh10等，不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构，由于其组织特异性（或亲嗜性）不同而被广泛应用。
图1. AAV载体疗法占在研病毒载体基因疗法的约80%
图2. 不同血清型组织递送特异性
AAV关键质量属性评估
之病毒颗粒数
2022年5月，国家药监局药审中心发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》通告，病毒颗粒数是重要的质量分析指标之一。全新推出的Octet® AAVX腺相关病毒定量生物传感器（货号：18-5160），消除目前定量方法通量低、成本高、耗时长的技术瓶颈，一键解锁各类血清学AAV病毒衣壳定量！
AAV定量痛点
- 为提高AAV病毒载体的质量和产品，需要在多个工艺步骤中快速定量AAV浓度，来高效地优化生产工艺环节
- 目前的方法费时费力费钱，速度慢，难以优化
- 时效性差，流程复杂。客户需要将样品送到分析部门或实验室检测，等待2~5天才会有结果。工艺流程需要等待结果进行下一步工作开展或优化调整
Octet® AAVX定量解决方案
- 基于药典认可的生物层干涉（BLI）技术
- Octet® R8/RH16/RH96高通量分子互作平台
- 5分钟即可一次性检测8/16/96个样品
- AAVX生物传感器，一步法直接定量纯化或粗样品
- 可结合各种血清型：AAV1 ~ AAV9及AAVrh10
- 线性范围宽广：8.5×108 ~ 1×1013 vp/mL
- 可再生重复使用~20次，单个样品检测成本更低
- Octet® BLI Discovery v.13.0.1 软件预设AAV定量模板
特异性高，动态范围广
Octet® AAVX传感器对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10等10种不同的AAV血清型具有良好特异性。
图3. Octet® AAVX对10种AAV血清型的特异性结合
大多数血清型的动态范围在8.5x108至1.0x1013 vp/mL之间，线性范围跨越5个数量级，无论高滴度和低滴度样品都能得到准确测量。且动态范围内测试的所有浓度均观察到良好的回收率 (80–120%) 和精密度 (CV<10%)。
图4. 使用Octet® AAVX生物传感器对纯化的AAV9衣壳定量
轻松消除基质干扰，粗样品表现优异
AAV的整个生产流程会用到不同的缓冲液和培养基基质，Octet® 对纯化样品和粗制样品均表现出优异的处理能力。使用样品稀释剂缓冲液对粗样品进行4倍至10倍稀释，即可显著减轻样品中基质效应。
点击了解不同血清型和
基质类型最小稀释系数
图6. 使用Octet® AAVX生物传感器对AAV9粗样品衣壳定量（含 1% Pluronic F-68的裂解缓冲液，稀释比例3:1；n=3）。结果显示浓度为3.05x109–2.22x1012 vp/mL。样品回收率在95–105%之间，并且受测浓度具有良好的精密度（CV<10%）。
与ELISA相关性
Octet® BLI搭配AAVX传感器可以实现快速的检测设置、分析和实时数据显示，从而能够监控和优化每个检测步骤。为了证实Octet® AAVX检测法和ELISA之间的相关性，来自BridgeBio Pharma和REGENXBIO公司的研究人员在AAV生物工艺流程的不同步骤测试了样品中的不同AAV血清型。
图7. 使用Octet® AAVX生物传感器和ELISA定量检测纯化样品及粗制样品（生物工艺中间体）中的AAV8和AAV9，数据显示两种方法具有良好的相关性。数据由REGENXBIO Inc.提供。
图8. 使用Octet® AAVX生物传感器和ELISA定量检测AAV生产上游和下游不同步骤中的AAV5（包括纯化样品及粗制样品）滴度。滴度范围为6.73x109至9.59x1013 vp/mL，证明Octet® AAVX检测法与ELISA之间具有良好的相关性。数据由BridgeBio Pharma, Inc.提供。
简单便捷，全面优化
| 方法 | 实验成本 | 样品制备 | CV% | 检测时间 |
| Octet® AAVX | 可以再生并重复使用多达20次, <5元/样品 | 无需或少量稀释，即可直接检测，不受基质影响 | < 10% | R8：90min/96孔板 RH16：45min/96孔板 RH96：5min/96孔板 |
| ELISA Kit | 10-20倍* | 需稀释上千倍，需要复孔，制备复杂，含包被、洗涤、孵育、二抗、终止等步骤 | 0-Jan-00 | 200~240min/96孔板 |
| ddPCR | 10-20倍* | 需要样品100倍倍比稀释，裂解、液滴制备等步骤 | < 10% | 360~480min/96孔板 |
总结
基于Octet® BLI 和Octet® AAVX 生物传感器的AAV定量检测策略可广泛应用于AAV 上游和下游工艺各阶段，优化传统终点法耗时费力的确定，提供可靠、准确且便捷的AAV定量新思路。
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