历经多年发展，嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法已成为癌症治疗的革命性方法，其中，CD19靶点药物在治疗B细胞恶性肿瘤方面更是取得了前所未有的成功，并于2017年获得美国FDA批准。其中，CAR分子设计及病毒包装是影响CAR-T细胞治疗有效性的重要环节，在前几期文章里，我们集中梳理了以下几个要点：

• 介绍CAR结构及其设计原则
• 盘点CAR-T细胞治疗的局限性及潜在风险
• 如何打破困局、提升治疗效果的创新策略

今天结合具体的研究案例数据，为大家展示在实际的应用情境中，我们可以如何更好地了解进而优化CAR分子设计、载体构建及病毒包装等一系列工艺流程。

CAR分子设计
CAR分子全称为嵌合抗原受体，其结构包括信号肽分子，抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区，共刺激分子结构域、CD3ζ信号转导域。

• scFv筛选：scFv亲和力和特异性对CAR分子功能有重要影响，筛选合适的scFv十分重要
• 连接基团（Linker）的优化：设计不同长度的Linker，使V_H和V_L之间的灵活度增加，进而影响结合亲和力
• 铰链区（Hinge）的优化：设计不同长度的Hinge，增加抗原结合域的空间灵活度
• 共刺激结构域的选择：可选择不同的共刺激分子（如4-1BB或CD28等）
• 报告基因：可连接绿色荧光蛋白基因，表征CAR分子是否转导成功

CAR分子结构示意图
 

表1 CAR分子设计中常用原件

载体构建
在设计好CAR分子后，通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上，构建后的其结构通常如图所示。赛业生物可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库，靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等，且该载体库还在不断的丰富和更新中。
 

CAR慢病毒载体结构图示

病毒包装和纯化
赛业生物在慢病毒制备方面具有多年的经验，可以提供多样化的慢病毒制备服务。我们使用了安全性高的第三代慢病毒包装系统，其制备流程如图所示。
 

慢病毒包装技术路线

解决策略推荐
基于多年在肿瘤免疫领域的研究经验，赛业生物可为CAR-T/其它细胞治疗研究者提供专业的CAR分子设计及载体构建、CAR慢病毒制备、靶抗原稳转细胞株构建等服务。

• 丰富的CAR分子设计经验，可提供专业的各种定制化的CAR分子设计服务
• 丰富的CAR慢病毒质粒载体库，可提供快速优质的服务
• 抗原高表达、高稳定性的稳转细胞株构建服务
• 高滴度高纯度的慢病毒制备
• 严格的质控标准

不仅如此，我们能给予你关于CAR-T/其他细胞治疗研发的全方位支持，从抗体开发、CAR病毒制备、免疫细胞制备和表型检测，到细胞模型与动物模型的构建、体外/体内药效评价一应俱全。

服务案例

• CD19抗原慢病毒滴度检测

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释（0.01、0.1、1、10μL四个梯度），分别加入到相同数量的293T细胞中，72小时后流式检测293T细胞阳性率(即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比)，进而计算慢病毒的转导滴度。如图所示，CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高，表明该慢病毒有良好的感染活性，并计算病毒滴度为：1.4×10⁸ TU/mL。
 

CD19抗原慢病毒滴度检测结果
 

• CD19-293T稳转细胞株构建

使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞，经过多轮筛选，得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。
 

CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果
 

• FMC63 CAR慢病毒滴度检测

我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子，并将其构建慢病毒载体上，进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度，病毒滴度约为：4.33×10⁸ TU/mL。
 

FMC63 CAR分子结构
 

FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果