细胞冻存实验的原理、步骤和注意事项
2023-06-14 来源:本站 点击次数:227实验原理：
随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70℃左右，酶活性几乎为0，代谢活动停止，可以实现长期保存。然而，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰”并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。因此常加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。
实验步骤：随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70℃左右，酶活性几乎为0，代谢活动停止，可以实现长期保存。然而，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰”并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。因此常加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。
2. 取形态良好，处于对数生长期的细胞，对其消化、离心 (1500rpm离心8min)、计数；
3. 根据细胞数量加入对应的冻存液，使细胞密度维持在300-500w/mL；
4. 小心用镊子打开冻存管管盖，每管分装1-1.5mL含细胞的冻存液，拧紧盖管，做好标记。
5. 分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放-80℃过夜；
6. 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；
7. 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。
注意事项：
1. 细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。当细胞快速冷冻时，水和离子往往会留在细胞中，细胞内冰晶的形成会撕裂和刺穿细胞膜。相反，如果细胞冷冻太过缓慢，则细胞外的水会在细胞内冰形成之前结冰。这允许水通过渗透作用逸出，但增加了可能有毒的细胞内溶质的浓度。因此对于大多数细胞，最佳冷冻速率在每分钟1℃之间。
2. DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。
3. 冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4℃时)，复苏存活率在80%～90%，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
4. 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液。
5. DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，冷却后再使用，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。
6. 细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。推荐密度为300-500w/mL。
7. 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒。
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