防范转基因花粉扩撒：花粉自清除CRISPR/Cas系统(PSEC)的开发
2023-06-30 来源:本站 点击次数:1306
近年来随着基因编辑技术的发展及在农作物育种领域的应用，相对于传统育种周期的8-10年，基因编辑育种可将育种周期缩短至3年左右，并可快速精准创制新的种质资源，有效提高作物产量、抗病虫害特性及品质性状等。比如基因编辑的水稻品种亩产提高15%以上、油酸含量达到80%以上的基因编辑大豆、产量提高10%以上的基因编辑玉米、抗除草剂小麦、强化甜度的草莓、强化风味的蔬菜等。全球范围内，基因编辑已经在水稻、玉米、大豆、小麦和番茄等农作物以及猪、牛、羊等农业动物中广泛应用，糯玉米、高油酸大豆、抗褐变马铃薯、高GABA番茄、抵抗褐变的蘑菇等基因编辑产品陆续在美国、日本等国家上市推广。
CRISPR/Cas基因编辑系统具有靶向精准、操作简便、突变类型丰富、应用范围广、效率高等突出优势，已成为农作物遗传改良的主要技术工具。当前，通过稳定遗传转化CRISPR/Cas是植物基因编辑的主要途径。然而，有性繁殖植物中，转基因元件可通过植物的花粉向自然与农业环境中扩散传播。玉米是典型的异交授粉植物，一个单株可产生200万至500万粒花粉，可能带来非预期的生物安全管理风险。前人已报道了一种“自杀式”转基因策略，可以产生无转基因的基因编辑植物以解决转基因扩散问题，对无性繁殖植物因无减数分裂重组以去除转基因成分，该方法也是理想的生物安全管理解决方案。然而，有多个基因编辑生物育种技术场景仍需活体中保持CRISPR/Cas存在，持续发生基因编辑靶向突变活性。因此，研发一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术，尤为必要。此外，玉米是世界上主要的粮食作物，紧凑矮杆等耐密株型遗传改良是当代玉米遗传与育种主要方向，降低株高具有抗倒、增密增产等农学意义。以某个特定的品种为“底盘”，创制系列降低株高同型衍生品种，对扩大该品种适应生态区域与生产应用推广，具有重要价值。
近日，中国农业科学院作科所及西北农林科技大学的联合研究团队在《Plant Communications》在线发表了题为“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究论文，介绍了研究团队开发了一种花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多个生长调节因子-GRF，通过引入花粉特异表达的能量耗竭元件，成功实现了含有PSEC元件的单倍体花粉不育，导致玉米植株世代稳定维持PSEC元件半合子杂合体，PSEC仅能通过雌性配子体向下一代遗传。同时，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因编辑活性，基于同一个材料创制出系列株高版本的同型衍生品系。
为了开发程序化的PSEC系统，研究团队在CRISPR/Cas9载体T-DNA中引入了一个雄性配子体失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，该基因由一个花粉特异性启动子驱动（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（图1A）。含有PSEC转基因的花粉是不能存活的，但PSEC转基因可以通过雌配子体遗传给下一代（图1B）。与受体材料杂交时，PSEC的Cas编辑活性被保留下来，并能产生新的等位基因靶向突变（图1C）。同时，研究团队设计了PSEC来靶向编码三种生长调节因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并获得了单一或多个突变体（图1A）。
研究团队利用PSEC针对玉米自交系ZC01的未成熟胚胎进行农杆菌介导的稳定转化，结果分离出25个独立的T0转化体。在对目标突变进行初步评估后，研究团队选择了5个转化体，通过数字液滴PCR来表征其PSEC拷贝数（图1D）。株系3-1和24-1携带一个PSEC转基因拷贝（图1D），入选特征分析的对象。株系3-1像野生型一样生长和开花，有正常的雄蕊和花药。经过KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊颜色浅，近一半的3-1单株花粉粒缺乏紫色的染色（图1E）。这些观察结果与研究团队以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方检验所示（χ2 < χ20.05,1；图1F），符合PSEC单拷贝的预期分离率。为了确认PSEC的存在与否，研究团队仔细地在体视显微镜下从株系3-1中采集了大约100个染色的花粉和100个未染色的花粉，并进行基因组DNA提取和Cas9 PCR扩增，三次重复。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC转基因（图1G）。
研究团队对株系3-1、3-4和3-7的自交后代进行基因型鉴定，通过Sanger测序确定目标突变，鉴定到Cas9阴性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的纯合单、双、三突变组合。这套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突变体可同时用于基因功能研究和育种（图1H），所有突变体都比WT短（图1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三个突变体可能不会产生基因剔除（KO），而可能产生弱等位基因。研究团队进一步对上述确认的KO突变的后代进行基因型鉴定和特征分析，结果发现其保留的PSEC的高突变活性。
为了研究PSEC转基因如何传播和遗传，研究团队用PSEC转基因T1作为花粉供体或受体与三个玉米自交系JD96M、D96F和B73杂交（图1I）。当使用株系3-2、3-3、3-6作为花粉供体时，通过PCR对JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6杂交产生的272、357和272个F1种子进行Cas9的基因型鉴定。结果显示，没有一个种子携带Cas9基因，表明PSEC不能通过3-2、3-3和3-6花粉传播和遗传。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73杂交产生的所有F1种子中约有一半检测到PSEC。这些数据与PSEC只能通过雌配子体传播和遗传的预期相一致。
为了测试可遗传的PSEC转基因是否表现出有效的靶向突变活性，研究团队用株系3-1作为雌性亲本，对上述每个杂交的40个F1种子进行基因型鉴定。在所有F1种子中，17.5-95%单株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每个靶点上都有所需的纯合/双等位突变（图1I）。这些数据表明，所需的突变可以通过以PSEC为母本的杂交有效产生。
总之，研究团队开发了一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术的基因编辑技术，该技术适用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技术；研究团队同时还创制了靶向ZmGRF获得特定品种系列矮杆同型衍生品种技术，为矮杆育种提供了新的技术策略和解决方案，具有种业应用潜力与价值。
北大荒垦丰种业-泽泉科技生物技术与表型服务中心是由北大荒垦丰种业股份有限公司和上海泽泉科技股份有限公司共同建设的开放式高通量植物基因型-表型-育种服务平台。中心建立了基因克隆和载体平台、作物转化系统、基因型分析平台、表型鉴定分析平台、数据分析和利用平台等现代化生物技术和信息支持平台，是定位于为植物科研和作物育种提供植物基因型-表型-育种数据分析的科研服务平台。
基因编辑服务+靶向测序服务方案
为了缩短您的育种进程，提高您的育种成功率，北大荒垦丰种业-泽泉科技生物技术与表型服务中心将为您提供水稻基因编辑服务。本方案利用基因编辑酶系统编辑供试材料的目的基因，在不改变其他基因的情况下迅速获取一批目的基因缺失型突变体。解决传统杂交选育中存在的周期长，基因连锁等难题。
技术路线：
靶向测序服务
靶向测序技术主要分为基于多重PCR的靶向基因捕获技术（GenoPlexs）和基于液相探针杂交的靶向基因捕获技术（GenoBaits）两种。可完成单样品50-5000和3000-40000标记的基因型分析，并达到可设计区域覆盖度高于95%，扩增子均一性高于90%的捕获效率。
应用领域：
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CRISPR/Cas基因编辑系统具有靶向精准、操作简便、突变类型丰富、应用范围广、效率高等突出优势，已成为农作物遗传改良的主要技术工具。当前，通过稳定遗传转化CRISPR/Cas是植物基因编辑的主要途径。然而，有性繁殖植物中，转基因元件可通过植物的花粉向自然与农业环境中扩散传播。玉米是典型的异交授粉植物，一个单株可产生200万至500万粒花粉，可能带来非预期的生物安全管理风险。前人已报道了一种“自杀式”转基因策略，可以产生无转基因的基因编辑植物以解决转基因扩散问题，对无性繁殖植物因无减数分裂重组以去除转基因成分，该方法也是理想的生物安全管理解决方案。然而，有多个基因编辑生物育种技术场景仍需活体中保持CRISPR/Cas存在，持续发生基因编辑靶向突变活性。因此，研发一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术，尤为必要。此外，玉米是世界上主要的粮食作物，紧凑矮杆等耐密株型遗传改良是当代玉米遗传与育种主要方向，降低株高具有抗倒、增密增产等农学意义。以某个特定的品种为“底盘”，创制系列降低株高同型衍生品种，对扩大该品种适应生态区域与生产应用推广，具有重要价值。
近日，中国农业科学院作科所及西北农林科技大学的联合研究团队在《Plant Communications》在线发表了题为“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究论文，介绍了研究团队开发了一种花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多个生长调节因子-GRF，通过引入花粉特异表达的能量耗竭元件，成功实现了含有PSEC元件的单倍体花粉不育，导致玉米植株世代稳定维持PSEC元件半合子杂合体，PSEC仅能通过雌性配子体向下一代遗传。同时，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因编辑活性，基于同一个材料创制出系列株高版本的同型衍生品系。
为了开发程序化的PSEC系统，研究团队在CRISPR/Cas9载体T-DNA中引入了一个雄性配子体失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，该基因由一个花粉特异性启动子驱动（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（图1A）。含有PSEC转基因的花粉是不能存活的，但PSEC转基因可以通过雌配子体遗传给下一代（图1B）。与受体材料杂交时，PSEC的Cas编辑活性被保留下来，并能产生新的等位基因靶向突变（图1C）。同时，研究团队设计了PSEC来靶向编码三种生长调节因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并获得了单一或多个突变体（图1A）。
图1花粉自清除CRISPR/Cas9（PSEC）消除含有转基因的花粉并保留目标突变
研究团队利用PSEC针对玉米自交系ZC01的未成熟胚胎进行农杆菌介导的稳定转化，结果分离出25个独立的T0转化体。在对目标突变进行初步评估后，研究团队选择了5个转化体，通过数字液滴PCR来表征其PSEC拷贝数（图1D）。株系3-1和24-1携带一个PSEC转基因拷贝（图1D），入选特征分析的对象。株系3-1像野生型一样生长和开花，有正常的雄蕊和花药。经过KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊颜色浅，近一半的3-1单株花粉粒缺乏紫色的染色（图1E）。这些观察结果与研究团队以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方检验所示（χ2 < χ20.05,1；图1F），符合PSEC单拷贝的预期分离率。为了确认PSEC的存在与否，研究团队仔细地在体视显微镜下从株系3-1中采集了大约100个染色的花粉和100个未染色的花粉，并进行基因组DNA提取和Cas9 PCR扩增，三次重复。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC转基因（图1G）。
研究团队对株系3-1、3-4和3-7的自交后代进行基因型鉴定，通过Sanger测序确定目标突变，鉴定到Cas9阴性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的纯合单、双、三突变组合。这套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突变体可同时用于基因功能研究和育种（图1H），所有突变体都比WT短（图1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三个突变体可能不会产生基因剔除（KO），而可能产生弱等位基因。研究团队进一步对上述确认的KO突变的后代进行基因型鉴定和特征分析，结果发现其保留的PSEC的高突变活性。
为了研究PSEC转基因如何传播和遗传，研究团队用PSEC转基因T1作为花粉供体或受体与三个玉米自交系JD96M、D96F和B73杂交（图1I）。当使用株系3-2、3-3、3-6作为花粉供体时，通过PCR对JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6杂交产生的272、357和272个F1种子进行Cas9的基因型鉴定。结果显示，没有一个种子携带Cas9基因，表明PSEC不能通过3-2、3-3和3-6花粉传播和遗传。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73杂交产生的所有F1种子中约有一半检测到PSEC。这些数据与PSEC只能通过雌配子体传播和遗传的预期相一致。
为了测试可遗传的PSEC转基因是否表现出有效的靶向突变活性，研究团队用株系3-1作为雌性亲本，对上述每个杂交的40个F1种子进行基因型鉴定。在所有F1种子中，17.5-95%单株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每个靶点上都有所需的纯合/双等位突变（图1I）。这些数据表明，所需的突变可以通过以PSEC为母本的杂交有效产生。
总之，研究团队开发了一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术的基因编辑技术，该技术适用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技术；研究团队同时还创制了靶向ZmGRF获得特定品种系列矮杆同型衍生品种技术，为矮杆育种提供了新的技术策略和解决方案，具有种业应用潜力与价值。
—— 参考文献 ——
Wang, H., Qi, X., Zhu, J., et al. Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize[J]. Plant Communications, 2023, 100637.
基因编辑服务+靶向测序服务方案
为了缩短您的育种进程，提高您的育种成功率，北大荒垦丰种业-泽泉科技生物技术与表型服务中心将为您提供水稻基因编辑服务。本方案利用基因编辑酶系统编辑供试材料的目的基因，在不改变其他基因的情况下迅速获取一批目的基因缺失型突变体。解决传统杂交选育中存在的周期长，基因连锁等难题。
技术路线：
靶向测序服务
靶向测序技术主要分为基于多重PCR的靶向基因捕获技术（GenoPlexs）和基于液相探针杂交的靶向基因捕获技术（GenoBaits）两种。可完成单样品50-5000和3000-40000标记的基因型分析，并达到可设计区域覆盖度高于95%，扩增子均一性高于90%的捕获效率。
GenoPlex基于多重PCR的靶向基因捕获技术方案
GenoBaits基于液相探针杂交的靶向基因捕获技术方案
应用领域：
| 种质资源分析 | 分子标记辅助选择 |
| 分子标记辅助回交改良 | 全基因组选择 |
| 全基因组关联分析 | 遗传图谱构建 |
| QTL定位 |
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