微流控技术的介绍及电阻抗谱测量以推断细胞的大小和速度
2023-09-19 来源:本站 点击次数:560
微流控技术（Microfluidics）作为一种在微观尺寸下操控微量体积流体的技术，是一门新兴的交叉学科，涉及微机械、流体、物理、材料、生物、化学和生物医学等领域 。因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片，也被称为芯片实验室（Lab on a Chip）和微全分析系统（micro-Total Analytical System（μTAS））。目前，微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。
生物医学的发展对细胞和亚细胞成分（细胞核，RNA，DNA）的电阻抗谱测量提出了更高的要求。与过去的几 MHz 的频率范围相比，现在的应用范围已经扩展到了更高的频段，并且同时需要具备更高的测量灵敏度。此外，在几个频率上同时进行测量的能力也很重要，因为这意味着可以在微流控中实时获取细胞的阻抗曲线。
目前有三种常见的方法来观察微流控通道中细胞的大小和速度。
第一种是基于光学方法的细胞计数。它需要使用激光照射微流控通道中已经标记好的细胞，并检测产生的散射或荧光。除了使用的染料可能有毒或昂贵之外，维护和设置激光及检测系统同样会限制该技术的便携性和耐用性。
第二种是基于图像的细胞计数。它依赖于高速相机的使用。在使用其它设备将细胞分类到不同通道之前，您需要通过进行图像处理来判断细胞的大小。普通摄像机的帧速会限制其检测速度，每记录一帧可能需要 200 微秒的时间。
第三种选择是阻抗细胞计数法。它具有快速的响应时间，无需标记且可集成分类操作。该技术基于监控细胞通过微流控通道中两个电极对时产生的介电特性的变化。其中一种方法使用锁相放大器，例如 OE2042，和匹配的电流放大器（Current Amplifier，CA） 来测量微流控通道中两个电极对之间电流的变化，具体连线如图1所示。由于实验中使用了差分电流测量的方法来测量电流的变化，来自流体的背景信号会在很大程度上被抑制。这使得测量到的电流信号更清晰，方便您从中推断出细胞的大小和速度。
详细微流控实验装置如图1所示，细胞悬浮液经过注射泵（Syringe pump，neMESYS，ce[1]toni GmbH，Korbussen，Germany）通过聚四氟乙烯管道（PTFE tube）进入微流控芯片（Microfluidic device）。悬浮液流速保持在 0.5 µL/min。由压力控制器（Pressure controller，OB1 MK3+，Elveflow，Paris，France）提供压强使得捕获孔位内外两侧压强不同从而进行细胞或测试微粒的捕获。而后由数字锁相放大器（DLIA）提供 1Vpp 的激励信号对捕获的细胞或测试微粒进行激励而后测量微流控芯片中反馈的电流信号。经由电流放大器（Current Amplifier，CA）转换为电压信号方便数字锁相放大器测量。然后在计算机（PC）端收集数据并计算细胞的阻抗信息。
生物医学的发展对细胞和亚细胞成分（细胞核，RNA，DNA）的电阻抗谱测量提出了更高的要求。与过去的几 MHz 的频率范围相比，现在的应用范围已经扩展到了更高的频段，并且同时需要具备更高的测量灵敏度。此外，在几个频率上同时进行测量的能力也很重要，因为这意味着可以在微流控中实时获取细胞的阻抗曲线。
目前有三种常见的方法来观察微流控通道中细胞的大小和速度。
第一种是基于光学方法的细胞计数。它需要使用激光照射微流控通道中已经标记好的细胞，并检测产生的散射或荧光。除了使用的染料可能有毒或昂贵之外，维护和设置激光及检测系统同样会限制该技术的便携性和耐用性。
第二种是基于图像的细胞计数。它依赖于高速相机的使用。在使用其它设备将细胞分类到不同通道之前，您需要通过进行图像处理来判断细胞的大小。普通摄像机的帧速会限制其检测速度，每记录一帧可能需要 200 微秒的时间。
第三种选择是阻抗细胞计数法。它具有快速的响应时间，无需标记且可集成分类操作。该技术基于监控细胞通过微流控通道中两个电极对时产生的介电特性的变化。其中一种方法使用锁相放大器，例如 OE2042，和匹配的电流放大器（Current Amplifier，CA） 来测量微流控通道中两个电极对之间电流的变化，具体连线如图1所示。由于实验中使用了差分电流测量的方法来测量电流的变化，来自流体的背景信号会在很大程度上被抑制。这使得测量到的电流信号更清晰，方便您从中推断出细胞的大小和速度。
详细微流控实验装置如图1所示，细胞悬浮液经过注射泵（Syringe pump，neMESYS，ce[1]toni GmbH，Korbussen，Germany）通过聚四氟乙烯管道（PTFE tube）进入微流控芯片（Microfluidic device）。悬浮液流速保持在 0.5 µL/min。由压力控制器（Pressure controller，OB1 MK3+，Elveflow，Paris，France）提供压强使得捕获孔位内外两侧压强不同从而进行细胞或测试微粒的捕获。而后由数字锁相放大器（DLIA）提供 1Vpp 的激励信号对捕获的细胞或测试微粒进行激励而后测量微流控芯片中反馈的电流信号。经由电流放大器（Current Amplifier，CA）转换为电压信号方便数字锁相放大器测量。然后在计算机（PC）端收集数据并计算细胞的阻抗信息。
Figure1. 微流控阻抗测试的整体架构图 (b).微流体装置的显微照片（比例尺为100 μm）
Figure2. 细胞微流控阻抗测量结果（标尺为 5 µm）
在幅频响应曲线（图2-b）中，没有捕获到粒子以及捕获到不同粒子的 幅频响应曲线在低频域与高频域都混合在一起难以分辨，而单靠幅频响应曲线难以确定最佳的频率点来区分粒子，故对测量得到的幅频响应曲线做归一化处理，即如下式所示进行计算。
Ar = A * Ae
其中 A 为不同粒子捕获后测量的幅值，Ae 为没有捕获到粒子是测量得到的幅值。经过归一化处理后可以看到，在频率为 2.5 MHz 时测量所得幅值最容易区分不同粒子。 故将输入激励信号的频率固定为 2.5 MHz 后重新对不同粒子进行多次测量，得到的结 果如图2-28d 所示。可以看到，针对不同粒子进行多组测量后得到的 6 µm 粒子平均幅 值为 0.9651，标准差（SD）为 0.0030，波动系数（CV）为 0.3141%，8 µm 粒子平均幅值 为 0.9514，标准差为 0.0028，波动系数为 0.2703%，10 µm 粒子平均幅值为 0.9384，标 准差为 0.0032，波动系数为 0.3387%。极小的标准差和波动系数表明本次测量的灵敏度 与稳定性都非常高，而差异明显的幅值平均值也是区分粒子的有力证据。
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