人血清白蛋白(HSA)在生物制药行业有着广泛的应用，包括血浆扩增、配方赋形剂、药物输送、伤口愈合以及作为融合搭档延长蛋白质药物的半衰期。由于人血清白蛋白的供应有限，无法满足临床需求，因此科研人员正在寻找其他来源的白蛋白，例如通过基因工程生产重组人血清白蛋白，以及各种各样的白蛋白融合蛋白已经被生产出来，以延长融合蛋白的循环半衰期，同时保持其活性。

目前，重组白蛋白的生产主要依赖于基因工程方法，通过酵母、CHO细胞或大肠杆菌等表达系统表达目标蛋白，再进行分离纯化等工艺。然而，在表达和纯化过程中，存在一些技术难题，如表达水平低、翻译后修饰不完全、纯化步骤繁琐且收率低等。
 

为了解决重组白蛋白融合蛋白纯化步骤繁琐且收率低的问题，Astrea Bioseparations与Albumedix【重组白蛋白产品的领先生产商和白蛋白融合蛋白技术的开发商(Veltis®)】合作开发了AlbuPure®，一种高度稳定、稳健、无毒、具有高结合能力、高回收率和高纯度的亲和色谱。符合ISO 9001质量标准的生产环境，可用于白蛋白及白蛋白融合蛋白的纯化和cGMP生产。

AlbuPure®是一种新型合成三嗪配基，源自Astrea Bioseparations的“Mimetic Ligand™ ”技术，并与其专利PuraBead®6HF琼脂糖基质偶联。该技术提供了稳定的基架和配体，可以使用1 M NaOH进行清洁，寿命较长。
 

AlbuPure®捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白案例分享：
材料与方法 
使用AlbuPure®在自动色谱工作站上纯化Albumedix酵母表达系统生产的不同白蛋白融合蛋白IL-1ra和anti-HIV gp41，在上样前都经过预处理。 

未结合蛋白和结合不紧密的蛋白通过平衡缓冲液去除。结合的非靶标蛋白随后使用一系列增加pH的缓冲液洗脱。白蛋白融合蛋白使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地洗脱。
 

表1:使用AlbuPure®从CCS中捕获纯化IL-1ra和anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白并去除宿主细胞蛋白(HCP)的色谱条件。 

*白蛋白融合蛋白-基因融合: 
(1) IL-1ra  - 18 kDa(大分子量) 
(2) gp41    - 5 kDa(小分子量) 
用稀乙酸调节得到pH为5.3的样品，电导率为~ 3mS /cm。 

结果与讨论 
一、IL-1ra白蛋白融合蛋白 
IL-1ra 白蛋白融合蛋白 （~85 kDa） 被 AlbuPure® 吸附剂捕获，非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列pH值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白，之后使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地从柱中洗脱白蛋白融合蛋白(图1)。通过SDS-PAGE分析工艺馏分(图2)。

图1:利用AlbuPure®从CCS中捕获和纯化IL-1ra白蛋白融合蛋白、去除HCP的色谱图。

图 2: 使用 AlbuPure® 纯化的 CCS 中 IL-1ra 白蛋白融合蛋白层析组分的SDS-PAGE. Lane 1: Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg).

SDS-PAGE 分析（图 2）表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中（lanes 2 and 3）。增加 pH 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的IL-1ra 白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。

二、anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白 
使用 AlbuPure® 捕获并纯化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白（~72 kDa）,非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列pH值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白(HCP)。gp41白蛋白融合蛋白选择性用辛酸钠从柱中洗脱（图3）;过程馏分通过SDS-PAGE进行分析（图 4）。  

图3:使用AlbuPure®从CCS中捕获和纯化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白的色谱图

SDS-PAGE分析(图4)表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中(lanes 2 and 3)。增加 pH 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。

图 4: 使用 AlbuPure® 纯化的 CCS 中anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白层析组分的 SDS-PAGE。 Lane: 1. Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg)

总结
AlbuPure®可用于从发酵和细胞培养上清液中捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白，如本案例所示，具有高纯度和回收率。   

AlbuPure®吸附剂已被用于纯化各种分子量的白蛋白融合蛋白：

此外，AlbuPure®能够以高达600厘米/小时的流速处理复杂的原料。因此，AlbuPure吸附剂可以通过缩短处理时间来显著降低制造成本，它具有高操作流速和高结合能力，以及重复再生使用的性能。 
 

参考资料 
Data courtesy of Albumedix Ltd: Use of a Novel Affinity Matrix as a Platform Purification for Albumin Fusions, Recovery of Biological Products XIV Conference presentation, Lake Tahoe, California, August 1st – 6th 2010.