同时，可实现核酸检测的绝对定量。达普生物研发团队全程参与了该技术的发明。

数字 PCR（dPCR）技术由于其绝对定量的能力和极高的灵敏度，被广泛的应用于分子诊断领域。然而，与目前的金标准定量 PCR （qPCR）相比，dPCR 在动态范围方面落后了 3~4 个数量级，这极大地限制了其在临床领域的应用。例如，对一些载量范围波动较大的病毒感染样本进行定量时，高载量的样本往往会使 dPCR 显全阳性而无法通过泊松分布定量。因此，亟需开发一种比目前的 dPCR 动态范围更大且简便易用的新的 dPCR 策略。

近期，上海科技大学刘一凡课题组与中科院上海微系统所、南方医科大学南方医院团队合作开发了荧光编码对数稀释数字 PCR 技术（Flodd-PCR），该方法展示出的动态范围为 10⁷，比传统 dPCR 高了逾两个量级。相关研究成果以“Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification”为题，发表在《Biosensors and Bioelectronics》上（DOI：doi.org/10.1016/j.bios.2023.115702）。上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组 2023 届硕士毕业生施清源、2021 级博士研究生李婕、南方医科大学南方医院检验科刘春辰博士为本文共同第一作者，上海科技大学刘一凡研究员、中科院微系统研究所罗源副研究员、南方医科大学南方医院郑磊教授为本文通讯作者。数字PCR设备（Nebula 全自动数字PCR系统）和试剂均由达普生物提供。

1. Flodd-PCR 基本工作原理

如图 1 所示，Flodd-PCR 的基本原理为在一次 dPCR 反应中引入四种对数稀释的样本浓度，每种稀释倍数分别对应一种浓度指示剂荧光强度；在 PCR 后，液滴将被根据荧光强度拆分成四组，每组分别进行拷贝数定量。如此以来，一次 Flodd-PCR 实验约等效于四组进行梯度稀释的、平行的 dPCR 实验，从而大幅提高了动态范围。

为了实现上述概念，研究团队首先设计并开发了一种微流控芯片，该芯片能够实现对检测样本的连续对数梯度稀释（20~1000 倍）和并行液滴生成（图 2），Flodd-PCR 芯片一共有两个入口，一个入口通入待检测的模板 DNA 样本和荧光指示剂，另一个入口通入 PCR 所需的其他试剂：酶、引物和探针等。上述两种溶液经过连续梯度稀释后将生成四组液滴，每组的液滴内 DNA 模板和荧光指示剂都稀释到一个特定的浓度，同时又使其他试剂（如引物、探针和聚合酶等）保持在正常工作浓度。在热循环后，利用商业化数字 PCR 液滴阅读仪同时读取 PCR 探针荧光和稀释指示剂荧光，最终根据荧光指示剂将混合的液滴分成四个聚类，并分别计算拷贝数。

图 1：Flodd-PCR 原理流程图图 2：Flodd-PCR 芯片设计及稀释性能表征

2. Flodd-PCR 的动态范围表现及临床有效性验证

接下来，研究团队通过一系列实验表征了 Flodd-PCR 的实际动态范围，如图 3 所示。实验结果表明常规 dPCR 的动态范围仅为 4~40,000 拷贝/µL，而 Flood-PCR 得益于连续梯度稀释的功能，能够将检测动态范围扩宽到 4~20,000,000 拷贝/µL。此外，团队还将 Flodd-PCR 和其他的代表性高动态范围 dPCR 方法进行了横向比较，结果表明 Flodd-PCR 在实现超高动态范围的同时并没有增加液滴的数量，这意味着 Flodd-PCR 的液滴读取和传统 dPCR 一样简便。

图 3：Flodd-PCR的动态范围标准

最后，为了验证 Flodd-PCR 在临床检测上的实用性，研究团队将其应用于临床患者样本中人乳头状瘤病毒 HPV（16型）的定量检测。HPV-16 作为高危病毒类型可以在 70% 的宫颈癌病例中发现，其病毒载量的动态区间可达 10⁷ 以上，远超出了传统 dPCR 的动态范围（约 10⁵）。实验结果表明（图 4），得益于更高的动态范围，Flodd-PCR 的定量成功率优于 dPCR，其定量结果也和金标准 qPCR 高度一致。以上结果表明，Flood-PCR 技术可以运用到真实的临床案例中。

综上所述，Flodd-PCR 是一种新颖的超高动态范围的数字 PCR 技术，其巧妙地运用了微流控技术和荧光编解码策略，实现了多种浓度样本检测的“多路复用”。该技术对传染性疾病临床样本检测性能表现优异， 如 HPV 检测， 定量成功率优于普通数字 PCR 系统，且定量结果和金标准方法保持一致，具有临床推广应用价值。

图 4：Flodd-PCR 对临床 HPV 样本的高动态范围定量