抗体筛选鉴定流程及应用范围介绍
2023-12-05 来源:本站 点击次数:1415
一、抗体鉴定：
1、抗体的效价鉴定：
鉴定效价的方法很多,包括有试管凝集反应,琼脂扩散试验,酶联免疫吸附试验等。常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法,以资比较。如制备抗抗体的效价,一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2、抗体的特异性鉴定：
抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高,它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线,计算各自的结合率,求出各自在IC50时的浓度,并按公式计算交叉反应率。
3、真核翻译起始因子2C2抗体的亲和力：
是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小,抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键,疏水键,侧链相反电荷基因的库仑力,范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示,K的单位是L/mol。
二、抗体筛选鉴定推荐流程：
1.包被免疫管：
将100ug 抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度过夜孵育。
2.封闭：
将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体 500ul 加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。
3.抗原和噬菌体孵育：
将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。
4.清洗：
将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。
5.洗脱：
往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库 扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。
6.ELISA鉴定：
将上一步筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后，取100ul加入到OD600为0.5的SS320菌液中，37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上，37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上，37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30度过夜培养。第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。
将过夜包被抗原和用3%BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。用含有0.05%吐温的PBS清洗3次后，用噬菌体抗体抗体作为一抗，用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列。
三、应用范围：
1.用于细菌、病毒、梅毒螺旋体、钩端螺旋体等微生物的抗原或抗体检查。
2.用于临床自身免疫病的多种自身抗体荧光检查，如抗核抗体，抗心肌抗体等。
3.细胞因子等检查的荧光流式细胞仪测定。
4.白细胞分型抗原的免疫荧光染色。
5.免疫组织及免疫病理中抗原，抗体检查，如各种肿瘤抗原检查。
1、抗体的效价鉴定：
鉴定效价的方法很多,包括有试管凝集反应,琼脂扩散试验,酶联免疫吸附试验等。常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法,以资比较。如制备抗抗体的效价,一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2、抗体的特异性鉴定：
抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高,它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线,计算各自的结合率,求出各自在IC50时的浓度,并按公式计算交叉反应率。
3、真核翻译起始因子2C2抗体的亲和力：
是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小,抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键,疏水键,侧链相反电荷基因的库仑力,范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示,K的单位是L/mol。
二、抗体筛选鉴定推荐流程：
1.包被免疫管：
将100ug 抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度过夜孵育。
2.封闭：
将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体 500ul 加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。
3.抗原和噬菌体孵育：
将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。
4.清洗：
将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。
5.洗脱：
往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库 扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。
6.ELISA鉴定：
将上一步筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后，取100ul加入到OD600为0.5的SS320菌液中，37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上，37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上，37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30度过夜培养。第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。
将过夜包被抗原和用3%BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。用含有0.05%吐温的PBS清洗3次后，用噬菌体抗体抗体作为一抗，用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列。
三、应用范围：
1.用于细菌、病毒、梅毒螺旋体、钩端螺旋体等微生物的抗原或抗体检查。
2.用于临床自身免疫病的多种自身抗体荧光检查，如抗核抗体，抗心肌抗体等。
3.细胞因子等检查的荧光流式细胞仪测定。
4.白细胞分型抗原的免疫荧光染色。
5.免疫组织及免疫病理中抗原，抗体检查，如各种肿瘤抗原检查。
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