ELISA实验中TMB显色底物详解
2023-12-19 来源:本站 点击次数:1901
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。
DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。
5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。
OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。
目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。
另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)是非常优越的酶免试验显色剂，能溶解于多种有机溶剂 和双蒸水中，为稳定的无色溶液，与适量过氧化脲或双氧水与缓冲液混匀后与过氧化物酶作用产生清晰的蓝色产物，极易观察。由于其灵敏度高，配制后的工作液稳定，加上无致癌特性，被广泛用于酶联免疫(ELISA)试验和尿试纸的检测反应等，TMB 主要应用于酶联免疫吸附实验(ELISA)，经典的方法是采用A、B 液分开配制，使用前再混合的方法，并且长期存放稳定，本试剂一般情况下为无色，有时略显浅蓝色或浅黄色。
TMB 底物显色试剂盒(ELISA,HRP 显色)主要由TMB 显色液、TMB buffer、 TMB 氧化剂组成，其特点是：
1、灵敏度高；
2、稳定性好，显色终止后读数稳定；
3、背景低：底物溶液在 450nm 检测时OD 值一般小于 0.05。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
操作步骤(仅供参考)：
1、用适当的干净容器(用纯净水反复冲洗)，取试剂(A)、(B)、(C)，按A：B：C= 5000：5000：4 的比例混合，即为TMB 显色工作液，待达到室温后即可使用。
2、加液：加完HRP 结合物并温育一定时间，洗板 3～5 次，每孔加TMB 显色工作液 100μl，在室温(15～25℃)或 37℃下温育 10～30 分钟。
3、(选做)终止：加等体积的 1M 盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。
4、读数：30min 内在 450nm 处读数。
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。
DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。
5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。
OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。
目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。
另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)是非常优越的酶免试验显色剂，能溶解于多种有机溶剂 和双蒸水中，为稳定的无色溶液，与适量过氧化脲或双氧水与缓冲液混匀后与过氧化物酶作用产生清晰的蓝色产物，极易观察。由于其灵敏度高，配制后的工作液稳定，加上无致癌特性，被广泛用于酶联免疫(ELISA)试验和尿试纸的检测反应等，TMB 主要应用于酶联免疫吸附实验(ELISA)，经典的方法是采用A、B 液分开配制，使用前再混合的方法，并且长期存放稳定，本试剂一般情况下为无色，有时略显浅蓝色或浅黄色。
TMB 底物显色试剂盒(ELISA,HRP 显色)主要由TMB 显色液、TMB buffer、 TMB 氧化剂组成，其特点是：
1、灵敏度高；
2、稳定性好，显色终止后读数稳定；
3、背景低：底物溶液在 450nm 检测时OD 值一般小于 0.05。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
操作步骤(仅供参考)：
1、用适当的干净容器(用纯净水反复冲洗)，取试剂(A)、(B)、(C)，按A：B：C= 5000：5000：4 的比例混合，即为TMB 显色工作液，待达到室温后即可使用。
2、加液：加完HRP 结合物并温育一定时间，洗板 3～5 次，每孔加TMB 显色工作液 100μl，在室温(15～25℃)或 37℃下温育 10～30 分钟。
3、(选做)终止：加等体积的 1M 盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。
4、读数：30min 内在 450nm 处读数。
相关文章
更多 >