活细胞成像应用于观察有丝分裂的研究
2024-03-12 来源:本站 点击次数:2055
有丝分裂（mitosis），又称为间接分裂，是指一种真核细胞分裂产生体细胞的过程。有丝分裂是将亲代细胞的染色体经过复制（实质为DNA的复制）以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质DNA，因而有丝分裂使得生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。
细胞进行有丝分裂具有周期性，即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期（G1，S，G2）和分裂期，分裂期又分为分裂前期、分裂中期、分裂后期和分裂末期。有丝分裂间期中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制。在分裂之前，细胞必须进行一定的物质准备。细胞增殖包括物质准备和细胞分裂整个过程。
另一方面， 由于癌细胞的生长和分裂不受细胞周期的控制，因此抗有丝分裂药物被用来抑制癌细胞的异常增殖。Nocodazole是治疗癌症的代表性抗癌抗有丝分裂药物，其作用机制是在细胞质和核分裂过程中干扰微管动力学，而微管的形成对有丝分裂至关重要[1]。
荧光标记是观察活细胞细胞器动态变化的有效工具。迄今为止，已经开发出多种质粒用于观察各种细胞器或荧光融合蛋白， 并且也进行了许多研究来验证各种刺激引起的细胞器或蛋白质易位的变化[2]。
Celloger® Mini Plus配备全自动摄像头， 可以在用户设定的间隔时间内对不同位置进行成像，这使得在不同条件下跟踪每个细胞的变化成为可能。
图3 Celloger Mini Plus设备图
因此，为了验证Nocodazole的抗有丝分裂作用，我们在HeLa细胞中稳定转染了绿色荧光蛋白H2B-GFP；然后在使用或不使用Nocodazole处理细胞后，通过Celloger® Mini Plus对细胞分裂进行实时监测。
应用实例：
将转染有H2B-GFP质粒的HeLa细胞以4×104个/孔的数量接种到24孔板中。 细胞用10%的胎牛血清和添加了300 ug/mL G418的DMEM培养基培养。 孔板培养过夜使细胞贴壁后， 加或不加62.5 nM 的Nocodazole孵育， 并用Celloger® Mini Plus进行实时成像（明场+GFP，10×物镜）。每15分钟拍摄一次图像，持续24小时。
图4 H2B-GFP转染HeLa细胞在有或无Nocodazole处理下的延时成像
在明场视野的图片中， 细胞核膜在开始时清晰可见， 随后逐渐消失。在明场和荧光图像中都能观察到在分裂中期染色体排列在细胞中心（图4A）。此时，染色体皱缩， 荧光比前一阶段更加强烈。染色体后期分裂为两个姐妹染色单体，每个染色单体移动到细胞的相反两级。正如最后一张图所示，两个子细胞最终在分裂末期形成。相反， 用Nocodazole处理的细胞，由于染色单体不能分裂到两端，细胞分裂过程没有继续进行。在明场下，细胞不再粘附在底部，同时荧光图像也证明DNA的最终断裂，导致细胞凋亡（图4B）。
结语：
Celloger® Mini Plus仪器体积小巧，可以放置在普通细胞培养箱中，并且可以承受自生热量，从而实现长期成像。通过优化荧光滤光片和光路，可以用最小的光强实时获得清晰的活细胞明场图像以及荧光图像。此外，Celloger® Mini Plus兼容多种类型的培养容器，位置重现性高，多点成像时扫描性能稳定。因此，Celloger® Mini Plus将为您的研究带来可靠的结果。
后续我们将为您继续介绍活细胞成像系统在不同研究下的应用实例，敬请关注。
参考文献：
[1] Endo K, Mizuguchi M, Harata A, Itoh G, Tanaka K. Nocodazole induces mitotic cell death with apoptotic-like features in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 2010 Jun 3;584(11):2387-92.
[2] Kanda T, Sullivan KF, Wahl GM. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 1998 Mar 26;8(7):377-85.
细胞进行有丝分裂具有周期性，即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期（G1，S，G2）和分裂期，分裂期又分为分裂前期、分裂中期、分裂后期和分裂末期。有丝分裂间期中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制。在分裂之前，细胞必须进行一定的物质准备。细胞增殖包括物质准备和细胞分裂整个过程。
另一方面， 由于癌细胞的生长和分裂不受细胞周期的控制，因此抗有丝分裂药物被用来抑制癌细胞的异常增殖。Nocodazole是治疗癌症的代表性抗癌抗有丝分裂药物，其作用机制是在细胞质和核分裂过程中干扰微管动力学，而微管的形成对有丝分裂至关重要[1]。
荧光标记是观察活细胞细胞器动态变化的有效工具。迄今为止，已经开发出多种质粒用于观察各种细胞器或荧光融合蛋白， 并且也进行了许多研究来验证各种刺激引起的细胞器或蛋白质易位的变化[2]。
Celloger® Mini Plus配备全自动摄像头， 可以在用户设定的间隔时间内对不同位置进行成像，这使得在不同条件下跟踪每个细胞的变化成为可能。
图3 Celloger Mini Plus设备图
因此，为了验证Nocodazole的抗有丝分裂作用，我们在HeLa细胞中稳定转染了绿色荧光蛋白H2B-GFP；然后在使用或不使用Nocodazole处理细胞后，通过Celloger® Mini Plus对细胞分裂进行实时监测。
应用实例：
将转染有H2B-GFP质粒的HeLa细胞以4×104个/孔的数量接种到24孔板中。 细胞用10%的胎牛血清和添加了300 ug/mL G418的DMEM培养基培养。 孔板培养过夜使细胞贴壁后， 加或不加62.5 nM 的Nocodazole孵育， 并用Celloger® Mini Plus进行实时成像（明场+GFP，10×物镜）。每15分钟拍摄一次图像，持续24小时。
图4 H2B-GFP转染HeLa细胞在有或无Nocodazole处理下的延时成像
在明场视野的图片中， 细胞核膜在开始时清晰可见， 随后逐渐消失。在明场和荧光图像中都能观察到在分裂中期染色体排列在细胞中心（图4A）。此时，染色体皱缩， 荧光比前一阶段更加强烈。染色体后期分裂为两个姐妹染色单体，每个染色单体移动到细胞的相反两级。正如最后一张图所示，两个子细胞最终在分裂末期形成。相反， 用Nocodazole处理的细胞，由于染色单体不能分裂到两端，细胞分裂过程没有继续进行。在明场下，细胞不再粘附在底部，同时荧光图像也证明DNA的最终断裂，导致细胞凋亡（图4B）。
结语：
Celloger® Mini Plus仪器体积小巧，可以放置在普通细胞培养箱中，并且可以承受自生热量，从而实现长期成像。通过优化荧光滤光片和光路，可以用最小的光强实时获得清晰的活细胞明场图像以及荧光图像。此外，Celloger® Mini Plus兼容多种类型的培养容器，位置重现性高，多点成像时扫描性能稳定。因此，Celloger® Mini Plus将为您的研究带来可靠的结果。
后续我们将为您继续介绍活细胞成像系统在不同研究下的应用实例，敬请关注。
参考文献：
[1] Endo K, Mizuguchi M, Harata A, Itoh G, Tanaka K. Nocodazole induces mitotic cell death with apoptotic-like features in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 2010 Jun 3;584(11):2387-92.
[2] Kanda T, Sullivan KF, Wahl GM. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 1998 Mar 26;8(7):377-85.
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